účinky muramidázy na smíšenou bakteriální komunitu

Abstrakt

v bakteriálních komunitách může jedna bakterie ovlivnit růst ostatních členů populace. Tyto interakce mohou být založeny na nutričních faktorech nebo mohou nastat prostřednictvím bakteriálních signálních molekul, které se uvolňují v médiu. Uvádíme příklad, který ukazuje, že kromě výše uvedených způsobů interakcí mohou muramidázy, enzymy, které specificky štěpí peptidoglykanové řetězce, také zprostředkovat interakce mezi bakteriemi. Pomocí fluorescenční hybridizace in situ demonstrujeme, že Lactococcus lactis muramidase AcmA může hydrolyzovat buněčnou stěnu Streptococcus thermophilus, aniž by to ovlivnilo životaschopnost. Tato mezibuněčná aktivita laktokokové muramidázy vede k narušení řetězce streptokoků in vivo. Naše data nás vedou k návrhu, že řetězce mohou poskytnout růstové výhody streptokokům v aerobních podmínkách.

1 Úvod

obecně se uznává, že bakterie žijící v komplexních bakteriálních komunitách může ovlivnit růst svých sousedů. Interakce mezi bakteriemi mohou být realizovány na výživném základě . Mezibuněčná komunikace také probíhá uvolňováním různých tříd signálních molekul do média, což umožňuje bakteriím regulovat širokou škálu funkcí, jako je autoagregace, snímání kvora, bakteriální diferenciace a přenos konjugačních plazmidů. Signální molekuly byly identifikovány jak u grampozitivních, tak u gramnegativních bakterií (pro přehled viz).

zde uvádíme výsledky, které ukazují, že muramidáza, bakteriální enzym, který specificky štěpí peptidoglykan, může také zprostředkovat interakce mezi bakteriemi.

bakterie mohou produkovat následující čtyři typy enzymů, které hydrolyzují peptidoglykan buněčné stěny: muramidázy, které jsou příkladem enzymů podobných lysozymu, glukosaminidázám, amidázám a určitým peptidázám. Aktivita peptidoglykan-hydrolázy kteréhokoli z těchto čtyř typů enzymů může způsobit autolýzu. Peptidoglykanové hydrolázy se také podílejí na procesech, jako je zahušťování a obrat peptidoglykanu, dělení buněk, kompetence buněk pro transformaci DNA, sporulace a bakteriální motilita .

Lactococcus lactis ssp. bylo hlášeno, že modelový kmen cremoris mg1363, vytvrzený z plazmidů a fágů, obsahuje pouze aktivitu muramidázy kódovanou genem acmA. Tato muramidáza je zodpovědná za autolýzu laktokoků . Zralý AcmA protein je přítomen jak v médiu, tak je připojen k povrchu buňky prostřednictvím jeho c-terminálních opakování . Gen acmA byl klonován a sekvenován a deleční mutant, MG1363acmAΔ1, byl konstruován; mutant tvoří dlouhé řetězce, což ukazuje zapojení muramidázy do separace laktokokových buněk . Řetězce mutantu acmA mohou být narušeny přidáním vyhořelého kultivačního média divokého typu MG1363 .

v této práci jsme zkoumali schopnost AcmA muramidázy L. lactis působit na streptokoky ve smíšené bakteriální populaci.

2 materiály a metody

2.1 bakteriální kmeny

2.2 růstové podmínky

experimenty byly provedeny v médiu M17glu (M17 vývar, doplněný 0,5% glukózy). Růstová teplota byla 30°C pro laktokoky a 42°C pro streptokoky a laktobacily. Bakteriální řetězce byly narušeny přidáním 0,01 mg ml-1 lysozymu (Boehringer, Heilderberg, Německo) do média, pokud není uvedeno jinak. Anaerobní podmínky byly vytvořeny ve sklenicích se sáčky Genbox Anaer (Biomérieux SA, Marcy l ‚ Etoile, Francie). Kultury pěstované v kapalném médiu v deskách byly udržovány na třepačce (Apelex, Massy, Francie, 25 výkyvů min−1), aby se zajistilo provzdušňování a aby se zabránilo bakteriální sedimentaci.

pro sedimentační studie byly bakterie pěstovány v plastových 1,5 ml spektrofotometrických kyvetách (Brand, Wertheim, Německo). Vhodná ředění laktokoků byla naočkována v kapalném nebo roztaveném polotekutém médiu (M17glu s 0, 0035% agarem, Difco, Detroit, USA). Po nočním růstu byly pořízeny fotografie kyvet pomocí filmu Sensia 400 (Fuji, Tokio, Japonsko).

2.3 fluorescenční hybridizace in situ (ryby), mikroskopie a analýza obrazu

buněčné směsi specificky zbarvené technikou FISH, se sondami specifickými pro laktokoky (LAC, označené fluoresceinem, zelená) a pro streptokoky (STR, označené rhodaminem, červená; P. Tailliez, nepublikované). Po hybridizaci byly snímky pořízeny pomocí epifluorescenčního mikroskopu (Nikon, Tokio, Japonsko) a systému analýzy obrazu Visiolab 1000 (Biocom, Les Ulis, Francie) a zpracovány pomocí programu Adobe Illustrator 7.0 (Edinburgh, Skotsko).

pro odhad délky bakteriálního řetězce byly buňky zbarveny 2,5 µg ml−1 DAPI (4,6-diamino-2-fenylindol, Sigma, St. Louis, USA), snímky byly zachyceny Visiolab 1000 a délka řetězce byla počítána ručně.

3 výsledky

3.1 narušení streptokokových řetězců laktokokovou muramidázou AcmA

domnívali jsme se, že kromě ovlivnění buněk stejného druhu může muramidáza MG1363 také ovlivnit tvorbu řetězců jiných druhů ve smíšené populaci. K testování jsme použili laktokokové kmeny MG1363 a jeho derivát acmA, stejně jako řetězec tvořící kmen s. thermophilus CNRZ7. V exponenciální fázi jsme smíchali noční kulturu streptokoků s laktokokovou kulturou. Po 3-h inkubaci při 30°C byly buněčné směsi fixovány a specificky zbarveny pomocí rybí techniky.

ve směsi streptokoků s MG1363 nejsou po 3 hodinách inkubace žádné streptokokové řetězce. Naproti tomu ve směsi CNRZ7 a MG1363acmAΔ1 jsou viditelné řetězce obou kmenů (obr. 1). Vzhledem k tomu, že MG1363acmAΔ1 a MG1363 jsou izogenní a liší se pouze v přítomnosti AcmA, dospěli jsme k závěru, že AcmA muramidáza je zodpovědná za narušení streptokokových řetězců. Kmen z jiného laktokokového poddruhu, L. lactis ssp. lactis IL1403, byl také schopen narušit streptokokové řetězce v podobných experimentech. V těchto smíšených kulturách působí laktokoková muramidáza jako mediátor interakcí mezi dvěma druhy, každý z jiného rodu, takže muramidáza jednoho druhu může ovlivnit schopnost tvorby řetězce jiného druhu.

zeptali jsme se, zda laktokoková muramidáza ovlivňuje životaschopnost streptokoků v těchto podmínkách. Buňky CNRZ7 v exponenciální nebo stacionární růstové fázi byly suspendovány v supernatantech kultury mg1363 a MG1363acmAΔ1. Po 4hodinové inkubaci nebyly pozorovány žádné rozdíly v životaschopnosti, jak bylo posouzeno pokovením nebo měřením OD.

3.2 vliv bakteriálních řetězců na sedimentaci

bakterie přítomné jako řetězce sedimentují rychleji než volné buňky. Při streptokocích vytvářejících řetězce (obr. 2a) nebo L. lactis MG1363acmAΔ1 (obr. 2c) se pěstují přes noc v kapalném médiu, tvoří sediment v nádobě. Kmen MG1363, který netvoří řetězce, nesedimentuje za stejných podmínek (obr. 2e). Použitím nízkých nebaktericidních koncentrací lysozymu bychom mohli převést řetězce CNRZ7 a mutantu MG1363acmAΔ1 do stavu jedné buňky; za těchto podmínek je jejich sedimentace snížena (obr. 2b a d). V polotekutém médiu lze rozlišit kolonie kmenů MG1363 a MG1363acmAΔ1. Kmen divokého typu tvoří pruhované kolonie (obr. 2h), stejně jako kmen MG1363acmAΔ1 pěstovaný lysozymem (obr. 2g). Tyto růstové vzorce naznačují, že oddělené buňky mají kapacitu, i když omezenou, na sediment v polotekutém médiu. Naproti tomu MG1363acmAΔ1 tvoří kulaté kolonie (obr. 2f), což může znamenat, že dlouhé řetězce zabraňují sedimentaci v tomto médiu.

tyto příklady ukazují, že distribuce bakterií v kapalném a polotekutém médiu je ovlivněna schopností buněk vytvářet řetězce.

3.3 růstové výhody s. thermophilus CNRZ7 díky schopnosti tvořit řetězce

jsme použili kmen s. thermophilus CNRZ7 k testování toho, jak schopnost vytvářet řetězce ovlivňuje růst bakterií. Streptokoky jsou považovány za fakultativní anaerobní látky . Jednodenní kultury těchto kmenů byly zředěny 1000krát v čerstvém kapalném médiu a kultury byly rozděleny na dvě části. Lysozym (0,01 mg ml−1) byl přidán do jednoho z alikvotů a každá kultura byla dále distribuována do šesti zkumavek a šesti Petriho destiček(25 ml na nádobu). Vzorky byly inkubovány bez třepání přes noc při 42°C. Další sada vzorků byla inkubována za anaerobních podmínek. OD600 všech vzorků byl měřen po 10násobném ředění ve stejném médiu, do kterého byl přidán lysozym (0,01 mg ml−1), aby se narušily řetězce. Výsledky ukazují (Tabulka 1), že růst buněk v řetězcích poskytuje výhodu streptokokům v provzdušněném prostředí. Ve všech případech kromě jednoho je bakteriální výnos vyšší, když jsou buňky pěstovány na deskách ve srovnání s zkumavkami. Lepší růst v deskách obsahujících kapalné médium lze vysvětlit rovnoměrnějším rozložením buněk na deskách ve srovnání s trubkami, což by mohlo umožnit větší přístup k živinám. Výjimka se týká streptokoků pěstovaných v deskách za aerobních podmínek s lysozymem. V tomto případě jsme pozorovali inhibici růstu ve srovnání s anaerobními podmínkami, s anaerobním: aerobním poměrem od600 1,4. Když byly buňky pěstovány ve zkumavkách, účinky provzdušňování byly sníženy a růstový poměr byl 1,1. Podobný poměr byl dosažen, když byly buňky pěstovány v médiu bez lysozymu (Tabulka 1).

inhibice streptokokového růstu za aerobních podmínek s lysozymem může být vysvětlena narušením řetězců do jednotlivých buněk a následně pomalejší sedimentací. Bylo hlášeno, že růst anaerobů v kapalném médiu bez třepání je inhibován na přibližně 0,5 cm od povrchu, protože proniká kyslík do média . V nepřítomnosti lysozymu vytváří CNRZ7 řetězce a sedimenty na dně nádoby pod zónou bohatou na kyslík; v tomto případě je OD600 na deskách o něco vyšší než v trubkách. Naproti tomu, když jsou bakterie pěstovány v médiu s lysozymem, netvoří dlouhé řetězce, jak je ověřeno mikroskopií a sedimentem pomaleji; v tomto případě zůstává více buněk v horní části cévy, tj. v inhibiční zóně. Vzhledem k tomu, že povrch inhibiční zóny je na deskách větší než v tubách, z toho vyplývá, že růst na deskách je inhibován více než růst v tubách. Hodnoty optické hustoty v deskách a trubicích potvrdily toto uvažování (Tabulka 1).

alternativním vysvětlením špatného aerobního růstu streptokoků v přítomnosti lysozymu by mohlo být to, že buňky jsou citlivější na lysozym v aerobních podmínkách nebo citlivější na kyslík v přítomnosti lysozymu. K řešení této otázky byl CNRZ7 pěstován přes noc v deskách jako v předchozím experimentu, ale s různými koncentracemi lysozymu. Souběžně byla udržována sada desek za podmínek třepání, aby se zabránilo sedimentaci a zvýšilo se provzdušňování. Jak je uvedeno na obr. 3, výtěžek bakterií pěstovaných třepáním se nesnížil v závislosti na koncentraci lysozymu. To znamená, že streptokoky se při přidávání lysozymu nestávají citlivějšími na kyslík. Nižší výnos kultur CNRZ7 pěstovaných za aerobních podmínek připisujeme vyšší inhibici kyslíku.

v aerobních podmínkách bez třepání pozorujeme postupné snižování výtěžku v rozmezí koncentrace lysozymu od 2 do 10 µg ml−1. Jak je uvedeno výše, vysvětlujeme to sedimentací bakteriálních řetězců do méně okysličené zóny na dně desek. V třepačce nepozorujeme tento pokles OD, protože je zabráněno sedimentaci. Za anaerobních podmínek lze zvýšení OD ve stejném rozmezí koncentrací lysozymu vysvětlit sníženou sedimentací a následnou rovnoměrnější distribucí bakterií v médiu. Mikroskopická pozorování jsou v souladu s tímto odůvodněním, protože délka řetězců CNRZ7 je více než 100 buněk v médiu bez lysozymu a postupně klesá na průměrnou hodnotu 2, když byla koncentrace lysozymu zvýšena na 10 µg ml−1. Délky řetězu byly přibližně stejné v aerobních a anaerobních podmínkách.

výše uvedené výsledky nás vedou k tomu, že anaerobní bakterie mohou mít růstové výhody, které závisí na jejich schopnosti vytvářet řetězce.

4 diskuse

ukázali jsme, že muramidáza zprostředkovává interakce mezi L. lactis MG1363 a s. thermophilus CNRZ7 a může určit délku řetězce „v trans“. Jak obecné může být toto chování? Lyofilizované buňky Micrococcus lysodeikticus se běžně používají jako indikátor autolytické aktivity. Výsledky různých laboratoří ukazují, že autolyziny různých bakteriálních druhů, např. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus nebo Staphylococcus aureus, mohou zničit peptidoglykan mikrokoků. Také jiné bakteriální peptidoglykanové hydrolázy, jako amidáza nebo glukosaminidáza, které jsou hlavními autolyziny Bacillus subtilis, mohou zničit peptidoglykan . Tyto údaje naznačují, že interakce prostřednictvím autolyzinů, které vedou k narušení řetězce, mohou existovat mezi mnoha bakteriálními druhy.

jednoduché vysvětlení pozorovaného narušení streptokokových řetězců spočívá v tom, že peptidoglykan je přímo hydrolyzován l. lactis muramidázou, která se uvolňuje MG1363 do média. K odhadu množství hydrolytické aktivity přítomné v supernatantech MG1363 byly provedeny zymogramy. Pomocí mikrokokových buněk jako substrátu jsme odhadli, že množství aktivity AcmA odpovídá přibližně aktivitě pozorované pro 0, 1 µg lysozymu(výsledky nejsou zobrazeny). Další faktory, jako jsou proteinázy, mohou také hrát roli v těchto interakcích: bylo prokázáno, že zavedení genu proteinázy ukotveného v klonované buněčné stěně v mutantu MG1363acmAΔ1 vede ke snížení velikosti řetězce . Bylo hlášeno, že laktokoková HtrA proteáza se podílí na degradaci AcmA muramidázy, což může také ovlivnit délku řetězce.

prokázali jsme účinnou aktivitu narušující streptokokový řetězec fylogeneticky odlišnými, ale přesto blízce příbuznými bakteriemi L. lactis ssp. cremoris MG1363 a L. lactis ssp. lactis IL1403 . Zajímavé je, že fylogeneticky vzdálenější L. helveticus kmeny CNRZ10940 a CNRZ1102, popsané jako autolysin pozitivní, nebyly schopny narušit řetězce MG1363acmAΔ1 nebo CNRZ7 za podmínek popsaných výše. To lze vysvětlit rozdíly v složení peptidoglykanu a specificitě peptidoglykanových hydroláz fylogeneticky odlišných bakterií .

zde popsaná role muramidáz může hrát důležitou roli ve smíšených bakteriálních populacích v přírodních podmínkách. Ukázali jsme, že existence bakterií ve stavu jedné buňky versus řetězce může mít v některých případech důsledky pro růst. Zničení řetězců a změny rychlosti sedimentace jsou pouze jedním příkladem možných účinků mezibuněčného působení peptidoglykan-hydroláz. Částečná hydrolýza bakteriální buněčné stěny může mít také další účinky. Například nedávno bylo prokázáno, že autolyziny ovlivňují primární připojení Staphylococcus epidermidis k pevným povrchům . Vzhledem k našim výsledkům je možné, že muramidázy jednoho druhu mohou ovlivnit tvorbu biofilmů jiného druhu v rámci smíšené komunity.

poděkování

děkujeme a. Gruss za kritické čtení rukopisu, G. Buist za dar kmene MG1363acmAΔ1, P. Duwat, i. Poquet, J. Richard, R. Cibik za stimulaci diskusí, P. Regent, B. Nicolas, m. Weber za pomoc při fotografické práci a M.Cavaroc za technickou pomoc. Děkujeme P. Tailliezovi za dar specifických fluorescenčních sond.