effekter af en muramidase på et blandet bakteriefællesskab

abstrakt

i bakteriesamfund kan en bakterie påvirke væksten hos andre medlemmer af befolkningen. Disse interaktioner kan være baseret på ernæringsmæssige faktorer eller kan forekomme via bakterielle signalmolekyler, der frigives i mediet. Vi præsenterer et eksempel, der viser, at ud over de ovennævnte interaktionsmetoder kan muramidaser, der specifikt spalter peptidoglycan-kæder, også formidle interaktioner mellem bakterier. Ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering demonstrerer vi, at Lactococcus lactis muramidase AcmA kan hydrolysere cellevæggen af Streptococcus thermophilus uden at påvirke levedygtigheden. Denne intercellulære aktivitet af lactokok muramidase resulterer i kædeforstyrrelse af streptokokker in vivo. Vores data får os til at foreslå, at kæder kan give vækstfordele til streptokokker under aerobe forhold.

1 Introduktion

det er almindeligt accepteret, at en bakterie, der lever i komplekse bakteriesamfund, kan påvirke væksten af sine naboer. Interaktioner mellem bakterier kan realiseres på næringsbasis . Intercellulær kommunikation sker også ved frigivelse i mediet af forskellige klasser af signalmolekyler, hvorved bakterier kan regulere en lang række funktioner, såsom autoaggregation, kvorum-sensing, bakteriel differentiering og overførsel af konjugative plasmider. Signalmolekyler er blevet identificeret i både Gram-positive og Gram-negative bakterier (til gennemgang, se ).

her præsenterer vi resultater, der viser, at muramidase, det bakterielle ferment, der specifikt spalter peptidoglycan, også kan formidle interaktioner mellem bakterier.

bakterier kan producere følgende fire typer af peptidoglycan, som hydrolyserer cellevæggen: muramidaser, som er eksemplificeret ved hjælp af glucosaminidaser, amidaser og visse peptidaser. Peptidoglycanhydrolaseaktiviteten af en hvilken som helst af disse fire typer kan forårsage autolyse. Peptidoglycanhydrolaser er også involveret i processer som peptidoglycanfortykning og omsætning, celledeling, cellekompetence til DNA-transformation, sporulation og bakteriel motilitet .

Lactococcus lactis ssp. cremoris model stamme MG1363, hærdet af plasmider og fager, blev rapporteret at kun indeholde muramidaseaktivitet kodet af genet acmA. Denne muramidase er ansvarlig for autolyse af lactokokker . Modent AcmA-protein er til stede både i mediet og fastgjort til celleoverfladen via dets C-terminale gentagelser . AcmA-genet blev klonet og sekventeret, og en deletionsmutant, Mg1363acma Purs1, blev konstrueret; mutanten danner lange kæder og viser således involvering af muramidase i laktokokcelleseparation . Kæder af acmA mutant kan forstyrres ved tilsætning af brugt dyrkningsmedium af vildtype MG1363 .

i dette arbejde undersøgte vi AcmA muramidase af L. lactis evne til at virke på streptokokker i en blandet bakteriepopulation.

2 Materialer og metoder

2.1 bakteriestammer

2.2 vækstbetingelser

eksperimenter blev udført i m17glu medium (M17 bouillon suppleret med 0,5% glucose ). Væksttemperaturen var 30 C for lactokokker og 42 C for streptokokker og lactobaciller. Bakteriekæder blev afbrudt ved tilsætning af 0,01 mg ml−1 lysosym (Boehringer, Heilderberg, Tyskland) til mediet, medmindre andet er angivet. Anaerobe forhold blev skabt i krukker med Genboks anaer-poser (biomasse SA, Marcy l ‘ Etoile, Frankrig). Kulturer dyrket i flydende medium i plader blev opretholdt på en ryster (Apeleks, Massy, Frankrig, 25 gynger min−1) for at tilvejebringe beluftning og for at forhindre bakteriel sedimentering.

til sedimentationsundersøgelser blev bakterier dyrket i plastik 1,5 ml spektrofotometer kuvetter (mærke, Vartheim, Tyskland). Passende fortyndinger af lactokokker blev inokuleret i flydende eller smeltet halvflydende medium (M17glu med 0,0035% agar, Difco, Detroit, USA). Efter vækst natten over blev fotografier af kuvetter taget ved hjælp af Sensia 400 film (Fuji, Tokyo, Japan).

2.3 fluorescerende in situ hybridisering (fisk), mikroskopi og billedanalyse

Celleblandinger, der er specifikt farvet ved hjælp af fisketeknikken, med prober, der er specifikke for lactokokker (LAC, mærket med fluorescein, grøn) og for streptokokker (STR, mærket med rhodamin, rød; P. Taillise, upubliceret). Efter hybridisering blev billeder taget ved hjælp af et epifluorescensmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) og Visiolab 1000 billedanalysesystem (Biocom, Les Ulis, Frankrig) og behandlet med Adobe Illustrator 7.0-program (Edinburgh, Skotland).

for at estimere bakteriekædelængden blev cellerne farvet med 2,5 liter ml−1 DAPI (4,6-diamino-2-phenylindol, Sigma, St. Louis, USA), billeder blev taget med Visiolab 1000, og kædelængden blev talt manuelt.

3 resultater

3.1 forstyrrelse af streptokokkæder med lactokok muramidase AcmA

vi overvejede, at MG1363 muramidase ud over at påvirke celler af samme art også kan påvirke kædedannelse af andre arter i blandet population. For at teste dette brugte vi lactokokstammer MG1363 og dets acmA-derivat samt en kædeformende S. thermophilus-stamme CNRS7. Vi blandede en overnight kultur af streptokokker med en lactokok kultur i eksponentiel fase. Efter en 3-h inkubation ved 30 liter C blev celleblandinger fikseret og specifikt farvet ved hjælp af fisketeknikken.

i blandingen af streptokokker med MG1363 er der ingen streptokokkæder tilbage efter 3 h inkubation. I modsætning hertil er kæder af begge stammer synlige (Fig. 1). Da Mg1363acma Kurr1 og MG1363 er isogene og kun adskiller sig i nærvær af AcmA, konkluderer vi, at AcmA muramidase er ansvarlig for forstyrrelse af streptokokkæder. Stammen fra en anden lactokok underart, L. lactis ssp. lactis IL1403, var også i stand til at forstyrre streptokokkæder i lignende forsøg. I disse blandede kulturer fungerer lactokok muramidasen som en formidler af interaktioner mellem to arter, hver af en anden slægt, således at muramidasen af en art kan påvirke en anden Arts kædeformende evne.

vi spurgte, om lactokok muramidase påvirker levedygtigheden af streptokokker under disse forhold. CNR7-celler i eksponentielle eller stationære vækstfaser blev suspenderet i kultur supernatanter af Mg1363 og Mg1363acma L1. Ingen forskelle i levedygtighed blev observeret efter 4 h inkubation, som bedømt ved plettering eller OD-måling.

3.2 indflydelse af bakteriekæder på sedimentering

bakterier til stede som kæder sediment hurtigere end frie celler. Når kædeformende streptokokker (Fig. 2a), eller L. lactis Mg1363acma kr1 (Fig. 2c) dyrkes natten over i flydende medium, de danner et sediment i beholderen. Den ikke-kædeformende stamme MG1363 sedimenterer ikke under de samme betingelser (Fig. 2e). Ved hjælp af lave ikke-bakteriedræbende koncentrationer af lysosym kan vi omdanne kæder af CNRS7 og af mg1363acma-mutanten til enkeltcelletilstand; under disse betingelser reduceres deres sedimentering (Fig. 2b og d). I halvflydende medium kan der skelnes mellem kolonier af stammerne MG1363 og Mg1363acma Lar1. Vildtypestammen danner stribede kolonier (Fig. 2h), ligesom mg1363acma-stammen, der er dyrket med lysosym (Fig. 2g). Disse vækstmønstre indikerer, at adskilte celler har kapacitet, selvom de er begrænsede, til sediment i halvflydende medium. I modsætning hertil danner Mg1363acma List 1 Runde kolonier (Fig. 2f), hvilket kan indikere, at de lange kæder forhindrer sedimentering i dette medium.

disse eksempler viser, at fordelingen af bakterier i flydende og halvflydende medium påvirkes af cellernes evne til at danne kæder.

3.3 vækst fordele ved S. thermophilus CNRS7 på grund af kædeformende evne

brugte vi S. thermophilus stamme CNRS7 til at teste, hvordan evnen til at danne kæder påvirker væksten af bakterier. Streptokokker anses for at være fakultative anaerober . Overnight kulturer af disse stammer blev fortyndet 1000 gange i frisk flydende medium, og kulturerne blev delt i to. 0,01 mg ml-1) blev tilsat til en af alikvoterne, og hver kultur blev derefter yderligere fordelt i seks rør og seks Petriplader (25 ml pr.beholder). Prøver blev inkuberet uden omrystning natten over kl 42 liter C. Et andet sæt prøver blev inkuberet under anaerobe forhold. OD600 af alle prøver blev målt efter 10 gange fortynding i det samme medium, hvortil der blev tilsat lysosym (0,01 mg ml−1) for at forstyrre kæder. Resultater indikerer (tabel 1), At vækst af celler i kæder giver streptokokker en fordel i luftet miljø. I alle tilfælde undtagen en er bakterieudbyttet højere, når celler dyrkes på plader sammenlignet med rør. Bedre vækst i plader indeholdende flydende medium kan forklares ved en mere jævn fordeling af celler på plader sammenlignet med rør, hvilket derved kunne give større adgang til næringsstoffer. Undtagelsen vedrører streptokokker dyrket i plader under aerobe forhold med lysosym. I dette tilfælde observerede vi væksthæmning sammenlignet med anaerobe forhold med et anaerobt:aerob OD600-forhold på 1,4. Når celler blev dyrket i rør, blev virkningerne af beluftning reduceret, og vækstforholdet var 1,1. Et lignende forhold blev opnået, når celler blev dyrket i medium uden lysosym (tabel 1).

inhiberingen af streptokokvækst under aerobe forhold med lysosyme kan forklares ved forstyrrelse af kæder i enkeltceller og følgelig langsommere sedimentering. Det blev rapporteret, at væksten af anaerober i flydende medium uden omrystning hæmmes til omkring 0,5 cm fra overfladen, på grund af indtrængning af ilt i mediet . I fravær af CNRS7 danner kæder og sedimenter til bunden af beholderen, under det iltrige område; i dette tilfælde er OD600 på plader lidt højere end i rør. I modsætning hertil, når bakterier dyrkes i medium med lysosym, danner de ikke lange kæder, som verificeret ved mikroskopi og sediment langsommere; i dette tilfælde forbliver flere celler i den øverste del af karret, dvs. i det hæmmende område. Da overfladen af inhiberingsområdet er større på plader end i rør, følger det, at vækst på plader er mere hæmmet end vækst i rør. Værdierne for optisk densitet i plader og rør bekræftede denne begrundelse (tabel 1).

en alternativ forklaring på dårlig aerob vækst af streptokokker i nærvær af lysosyme kan være, at celler er mere følsomme over for lysosyme under aerobe forhold eller mere følsomme over for ilt i nærvær af lysosyme. For at løse dette spørgsmål blev CNRS7 dyrket natten over i plader som i det foregående forsøg, men med forskellige koncentrationer af lysosym. Parallelt blev et sæt plader opretholdt under rystebetingelser for at forhindre sedimentering og for at øge beluftningen. Som vist i Fig. 3, faldt udbyttet af bakterier, der blev dyrket med omrystning, ikke som en funktion af lysosymkoncentrationen. Dette betyder, at streptokokker ikke bliver mere følsomme over for ilt, når de tilsættes. Vi tilskriver lavere udbytte af CNR7-kulturer dyrket under aerobe forhold til højere ilthæmning.

under aerobe forhold uden omrystning observerer vi et gradvist fald i udbyttet i lysosymkoncentrationsområdet fra 2 til 10 liter ml−1. Som ovenfor forklarer vi dette ved sedimentering af bakteriekæder til det mindre iltede område i bunden af pladerne. I rysteren observerer vi ikke dette fald i OD, da sedimentering forhindres. Under anaerobe forhold kan stigningen i OD i det samme interval af lysosymkoncentrationer forklares ved reduceret sedimentering og efterfølgende mere jævn fordeling af bakterier i mediet. Mikroskopiske observationer er i overensstemmelse med denne begrundelse, da længden af CNRS7−kæder er mere end 100 celler i medium uden lysosym og gradvist falder til en gennemsnitlig værdi på 2, når lysosymkoncentrationen blev forøget til 10 liter ml-1. Kædelængder var omtrent de samme under aerobe og anaerobe forhold.

ovenstående resultater får os til at foreslå, at anaerobe bakterier kan have vækstfordele, der afhænger af deres evne til at danne kæder.

4 Diskussion

vi har vist, at muramidase formidler interaktioner mellem L. lactis MG1363 og S. thermophilus CNRS7 og kan bestemme kædelængden ‘i trans’. Hvor generel kan denne form for adfærd være? Lyofiliserede Mikrococcus lysodeikticus-celler anvendes rutinemæssigt som en indikator for autolytisk aktivitet. Resultater fra forskellige laboratorier viser, at autolysiner af forskellige bakteriearter, f. eks. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus eller Staphylococcus aureus, kan ødelægge peptidoglycan af micrococci. Også andre bakterielle peptidoglycanhydrolaser, som amidase eller glucosaminidase, som er store autolysiner af Bacillus subtilis, kan ødelægge peptidoglycan . Disse data tyder på, at interaktioner via autolysiner, som resulterer i kædeforstyrrelser, kan eksistere mellem mange bakteriearter.

en simpel forklaring på den observerede forstyrrelse af streptokokkæder er, at peptidoglycan hydrolyseres direkte af L. lactis muramidase, der frigives af MG1363 i mediet. For at estimere mængden af hydrolytisk aktivitet til stede i mg1363 supernatanter. Ved hjælp af mikrokokkale celler som substrat estimerede vi mængden af AcmA-aktivitet til at svare omtrent til den, der blev observeret for 0,1 liter lysosym (resultater ikke vist). Andre faktorer, såsom proteinaser, kan også spille en rolle i disse interaktioner: det blev vist, at introduktion af klonet cellevægsforankret proteinasegen i Mg1363acma-Mutant resulterer i reduktion af kædestørrelse . Lactokok-HtrA-protease blev rapporteret at være involveret i nedbrydning af AcmA muramidase , hvilket også kan påvirke kædelængden.

vi demonstrerede effektiv streptokokkædeforstyrrende aktivitet af fylogenetisk forskellige, men ikke desto mindre nært beslægtede bakterier L. lactis ssp. cremoris MG1363 og L. lactis ssp. lactis IL1403 . Interessant, fylogenetisk mere fjerntliggende L. helveticus-stammerne CNRC10940 og CNRC1102, beskrevet som autolysin-positive, var ude af stand til at forstyrre kæder af Mg1363acma-Chol1 eller CNRC7 under betingelser beskrevet ovenfor. Dette kan forklares ved forskelle i peptidoglycan sammensætning og specificitet af peptidoglycan hydrolaser af fylogenetisk forskellige bakterier .

muramidasernes rolle beskrevet her kan spille en vigtig rolle i blandede bakteriepopulationer under naturlige forhold. Vi har vist, at eksistensen af bakterier i enkeltcelletilstand versus kæder i nogle tilfælde kan have konsekvenser for vækst. Ødelæggelse af kæder og ændringer i sedimenteringshastighed er kun et eksempel på mulige virkninger af den intercellulære virkning af peptidoglycanhydrolaser. Delvis hydrolyse af bakteriecellevæggen kan også have andre virkninger. For eksempel blev det for nylig vist, at autolysiner påvirker primær binding af Staphylococcus epidermidis til faste overflader . I betragtning af vores resultater er det muligt, at muramidaser af en art kunne påvirke dannelsen af biofilm af en anden art inden for et blandet samfund.

anerkendelser

vi takker A. Gruss for kritisk læsning af manuskriptet, G. Buist for gaven til mg1363acma-stammen, P. Duvat, I. Poket, J. Richard, R. Cibik for at stimulere diskussioner, P. Regent, B. Nicolas, M. Viber for hjælp til fotoarbejde og M. Cavaroc for teknisk hjælp. Vi takker P. Taillise for gaven af specifikke fluorescerende prober.