Auswirkungen einer Muramidase auf eine gemischte Bakteriengemeinschaft

Zusammenfassung

In Bakteriengemeinschaften kann ein Bakterium das Wachstum anderer Populationsmitglieder beeinflussen. Diese Wechselwirkungen können auf Ernährungsfaktoren beruhen oder über bakterielle Signalmoleküle auftreten, die im Medium freigesetzt werden. Wir stellen ein Beispiel vor, das zeigt, dass Muramidasen, Enzyme, die Peptidoglycanketten spezifisch spalten, zusätzlich zu den oben genannten Wechselwirkungen auch Wechselwirkungen zwischen Bakterien vermitteln können. Durch fluoreszierende In-situ-Hybridisierung zeigen wir, dass Lactococcus lactis muramidase AcmA die Zellwand von Streptococcus thermophilus hydrolysieren kann, ohne die Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Diese interzelluläre Aktivität der Lactokokken-Muramidase führt in vivo zu einer Kettenunterbrechung von Streptokokken. Unsere Daten lassen vermuten, dass Ketten Streptokokken unter aeroben Bedingungen Wachstumsvorteile verschaffen können.

1 Einleitung

Es ist allgemein anerkannt, dass ein Bakterium, das in komplexen Bakteriengemeinschaften lebt, das Wachstum seiner Nachbarn beeinflussen kann. Wechselwirkungen zwischen Bakterien können auf ernährungsphysiologischer Basis realisiert werden . Die interzelluläre Kommunikation erfolgt auch durch Freisetzung verschiedener Klassen von Signalmolekülen in das Medium, wodurch Bakterien eine Vielzahl von Funktionen wie Autoaggregation, Quorum-Sensing, bakterielle Differenzierung und Transfer von konjugativen Plasmiden regulieren können. Signalmoleküle wurden sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien identifiziert (zur Überprüfung siehe ).

Hier präsentieren wir Ergebnisse, die zeigen, dass Muramidase, das bakterielle Enzym, das Peptidoglycan spezifisch spaltet, auch Interaktionen zwischen Bakterien vermitteln kann.

Bakterien können die folgenden vier Arten von Enzymen produzieren, die Zellwandpeptidoglycan hydrolysieren: Muramidasen, die durch lysozymartige Enzyme, Glucosaminidasen, Amidasen und bestimmte Peptidasen veranschaulicht werden. Die Peptidoglycanhydrolaseaktivität einer dieser vier Arten von Enzymen kann Autolyse verursachen. Peptidoglycanhydrolasen sind auch an Prozessen wie Peptidoglycanverdickung und -umsatz, Zellteilung, Zellkompetenz für DNA-Transformation, Sporulation und Bakterienmotilität beteiligt .

Lactococcus lactis ssp. es wurde berichtet, dass der aus Plasmiden und Phagen gehärtete Cremoris-Modellstamm MG1363 nur Muramidaseaktivität enthielt, die durch das Gen acmA kodiert wurde. Diese Muramidase ist für die Autolyse von Lactokokken verantwortlich . Das reife AcmA-Protein ist sowohl im Medium vorhanden als auch über seine C-terminalen Wiederholungen an die Zelloberfläche gebunden. Das acmA-Gen wurde kloniert und sequenziert, und eine Deletionsmutante, MG1363acmAΔ1, wurde konstruiert; Die Mutante bildet lange Ketten und zeigt so die Beteiligung von Muramidase an der Lactokokkenzellseparation . Ketten der acmA-Mutante können durch Zugabe von verbrauchtem Kulturmedium des Wildtyps MG1363 unterbrochen werden.

In dieser Arbeit untersuchten wir die Fähigkeit von AcmA muramidase von L. lactis, auf Streptokokken in einer gemischten Bakterienpopulation zu wirken.

2 Materialien und Methoden

2.1 Bakterienstämme

2.2 Wachstumsbedingungen

Experimente wurden in M17glu-Medium (M17-Brühe, ergänzt mit 0,5% Glucose) durchgeführt. Die Wachstumstemperatur betrug 30 ° C für Laktokokken und 42 ° C für Streptokokken und Laktobazillen. Bakterienketten wurden durch Zugabe von 0,01 mg ml−1 Lysozym (Boehringer, Heilderberg, Deutschland) zum Medium unterbrochen, sofern nicht anders angegeben. Anaerobe Bedingungen wurden in Gläsern mit anaeroben Genbox-Sachets (Biomérieux SA, Marcy l’Etoile, Frankreich) geschaffen. Kulturen, die in flüssigem Medium in Platten gezüchtet wurden, wurden auf einem Schüttler (Apelex, Massy, Frankreich, 250 min−1) gehalten, um eine Belüftung zu gewährleisten und eine Bakteriensedimentation zu verhindern.

Für Sedimentationsstudien wurden Bakterien in 1,5 ml-Spektralphotometerküvetten aus Kunststoff (Brand, Wertheim, Deutschland) gezüchtet. Entsprechende Verdünnungen von Lactokokken wurden in flüssigem oder geschmolzenem halbflüssigem Medium (M17glu mit 0,0035% Agar, Difco, Detroit, USA) beimpft. Nach dem Wachstum über Nacht wurden Fotos von Küvetten mit Sensia 400 Film (Fuji, Tokio, Japan) aufgenommen.

2.3 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Mikroskopie und Bildanalyse

Mit der FISH-Technik spezifisch gefärbte Zellmischungen mit Sonden spezifisch für Lactokokken (LAC, markiert mit Fluorescein, grün) und für Streptokokken (STR, markiert mit Rhodamin, rot; P. Tailliez, unveröffentlicht). Nach der Hybridisierung wurden Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Nikon, Tokio, Japan) und dem Bildanalysesystem Visiolab 1000 (Biocom, Les Ulis, Frankreich) aufgenommen und mit dem Programm Adobe Illustrator 7.0 (Edinburgh, Schottland) verarbeitet.

Zur Abschätzung der bakteriellen Kettenlänge wurden Zellen mit 2,5 µg ml−1 DAPI (4,6-diamino-2-phenylindol, Sigma, St. Louis, USA) gefärbt, Bilder mit Visiolab 1000 aufgenommen und die Kettenlänge manuell gezählt.

3 Ergebnisse

3.1 Unterbrechung der Streptokokkenketten durch Lactokokken-Muramidase AcmA

Wir gingen davon aus, dass die MG1363-Muramidase nicht nur Zellen derselben Spezies beeinflusst, sondern auch die Kettenbildung anderer Spezies in gemischten Populationen beeinflussen kann. Um dies zu testen, verwendeten wir Lactokokkenstämme MG1363 und sein acmA-Derivat sowie einen kettenbildenden S. thermophilus-Stamm CNRZ7. Wir mischten eine Übernachtkultur der Streptokokken mit einer Lactokokkenkultur in exponentieller Phase. Nach einer 3-stündigen Inkubation bei 30°C wurden Zellmischungen fixiert und mit der FISH-Technik gezielt gefärbt.

In der Mischung von Streptokokken mit MG1363 verbleiben nach 3 h Inkubation keine Streptokokkenketten mehr. Im Gegensatz dazu sind in der Mischung aus CNRZ7 und MG1363acmAΔ1 Ketten beider Stämme sichtbar (Abb. 1). Da MG1363acmAΔ1 und MG1363 isogen sind und sich nur in Gegenwart von AcmA unterscheiden, schließen wir, dass die AcmA-Muramidase für die Unterbrechung der Streptokokkenketten verantwortlich ist. Der Stamm aus einer anderen Lactokokken-Unterart, L. lactis ssp. lactis IL1403 konnte in ähnlichen Experimenten auch Streptokokkenketten unterbrechen. In diesen Mischkulturen wirkt die Lactokokken-Muramidase als Vermittler von Wechselwirkungen zwischen zwei Spezies, die jeweils einer anderen Gattung angehören, so dass die Muramidase einer Spezies die Kettenbildungsfähigkeit einer anderen Spezies beeinflussen kann.

Wir fragten, ob Lactokokken-Muramidase die Lebensfähigkeit von Streptokokken unter diesen Bedingungen beeinflusst. CNRZ7-Zellen in exponentiellen oder in stationären Wachstumsphasen wurden in Kulturüberständen von MG1363 und MG1363acmAΔ1 suspendiert. Nach 4-stündiger Inkubation wurden keine Unterschiede in der Lebensfähigkeit beobachtet, wie durch Plattierungs- oder OD-Messung beurteilt.

3.2 Einfluss von Bakterienketten auf die Sedimentation

Als Ketten vorliegende Bakterien sedimentieren schneller als freie Zellen. Bei kettenbildenden Streptokokken (Abb. 2a) oder L. lactis MG1363acmAΔ1 (Fig. 2c) werden über Nacht in flüssigem Medium gezüchtet, sie bilden ein Sediment im Gefäß. Der nicht kettenbildende Stamm MG1363 sedimentiert unter den gleichen Bedingungen nicht (Abb. 2e). Mit niedrigen nicht-bakteriziden Konzentrationen von Lysozym konnten Ketten von CNRZ7 und der Mutante MG1363acmAΔ1 in den Einzelzellzustand überführt werden; unter diesen Bedingungen ist ihre Sedimentation reduziert (Abb. 2b und d). In halbflüssigem Medium können Kolonien der Stämme MG1363 und MG1363acmAΔ1 unterschieden werden. Der Wildtyp-Stamm bildet Streifenkolonien (Abb. 2h), wie auch der mit Lysozym gewachsene Stamm MG1363acmAΔ1 (Fig. 2g). Diese Wachstumsmuster weisen darauf hin, dass getrennte Zellen die Fähigkeit haben, in halbflüssigem Medium zu sedimentieren, obwohl sie begrenzt sind. Im Gegensatz dazu bildet MG1363acmAΔ1 runde Kolonien (Abb. 2f), was darauf hindeuten kann, dass die langen Ketten eine Sedimentation in diesem Medium verhindern.

Diese Beispiele zeigen, dass die Verteilung von Bakterien in flüssigem und halbflüssigem Medium durch die Fähigkeit von Zellen beeinflusst wird, Ketten zu bilden.

3.3 Wachstumsvorteile von S. thermophilus CNRZ7 aufgrund der Kettenbildungsfähigkeit

Wir haben S. thermophilus Stamm CNRZ7 verwendet, um zu testen, wie die Fähigkeit, Ketten zu bilden, das Wachstum von Bakterien beeinflusst. Streptokokken gelten als fakultative Anaerobier . Übernachtkulturen dieser Stämme wurden in frischem flüssigem Medium 1000fach verdünnt und die Kulturen in zwei Hälften geteilt. Lysozym (0,01 mg ml-1) wurde zu einem der Aliquots gegeben, und jede Kultur wurde dann weiter in sechs Röhrchen und sechs Petriplatten (25 ml pro Gefäß) verteilt. Die Proben wurden ohne Schütteln über Nacht bei 42°C inkubiert. Ein weiterer Probensatz wurde unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Die OD600 aller Proben wurde nach 10-facher Verdünnung in demselben Medium gemessen, zu dem Lysozym (0,01 mg ml−1) zugegeben wurde, um Ketten zu unterbrechen. Die Ergebnisse zeigen (Tabelle 1), dass das Wachstum von Zellen in Ketten Streptokokken in belüfteter Umgebung einen Vorteil verschafft. In allen Fällen bis auf einen ist die Bakterienausbeute höher, wenn Zellen auf Platten im Vergleich zu Röhrchen gezüchtet werden. Ein besseres Wachstum in Platten mit flüssigem Medium lässt sich durch eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen auf Platten im Vergleich zu Röhrchen erklären, die dadurch einen besseren Zugang zu Nährstoffen ermöglichen könnten. Die Ausnahme betrifft Streptokokken, die in Platten unter aeroben Bedingungen mit Lysozym gezüchtet wurden. In diesem Fall beobachteten wir eine Wachstumshemmung im Vergleich zu anaeroben Bedingungen mit einem anaeroben: aeroben OD600-Verhältnis von 1,4. Wenn Zellen in Röhrchen gezüchtet wurden, waren die Auswirkungen der Belüftung verringert, und das Wachstumsverhältnis betrug 1,1. Ein ähnliches Verhältnis wurde erhalten, wenn Zellen in Medium ohne Lysozym gezüchtet wurden (Tabelle 1).

Die Hemmung des Streptokokkenwachstums unter aeroben Bedingungen mit Lysozym kann durch die Unterbrechung von Ketten in einzelne Zellen und folglich eine langsamere Sedimentation erklärt werden. Es wurde berichtet, dass das Wachstum von Anaerobiern in flüssigem Medium ohne Schütteln aufgrund des Eindringens von Sauerstoff in das Medium auf etwa 0,5 cm von der Oberfläche gehemmt wird . In Abwesenheit von Lysozym bildet CNRZ7 Ketten und Sedimente am Boden des Behälters unterhalb der sauerstoffreichen Zone; In diesem Fall ist der OD600 auf Platten etwas höher als in Rohren. Im Gegensatz dazu, wenn Bakterien in Medium mit Lysozym gezüchtet werden, bilden sie keine langen Ketten, wie durch Mikroskopie verifiziert und sedimentieren langsamer; In diesem Fall verbleiben mehr Zellen im oberen Teil des Gefäßes, d.h. in der Hemmzone. Da die Oberfläche der Hemmzone auf Platten größer ist als in Rohren, folgt daraus, dass das Wachstum auf Platten stärker gehemmt wird als das Wachstum in Rohren. Die Werte der optischen Dichte in Platten und Rohren bestätigten diese Argumentation (Tabelle 1).

Eine alternative Erklärung für ein schlechtes aerobes Wachstum von Streptokokken in Gegenwart von Lysozym könnte sein, dass Zellen unter aeroben Bedingungen empfindlicher auf Lysozym oder in Gegenwart von Lysozym empfindlicher auf Sauerstoff reagieren. Um diese Frage zu beantworten, wurde CNRZ7 wie im vorherigen Experiment über Nacht in Platten gezüchtet, jedoch mit unterschiedlichen Lysozymkonzentrationen. Parallel dazu wurde ein Satz Platten unter Schüttelbedingungen gehalten, um Sedimentation zu verhindern und die Belüftung zu erhöhen. Wie in Fig. 3, die Ausbeute an mit Schütteln gewachsenen Bakterien nahm in Abhängigkeit von der Lysozymkonzentration nicht ab. Dies bedeutet, dass Streptokokken bei Zugabe von Lysozym nicht sauerstoffempfindlicher werden. Wir führen eine geringere Ausbeute an CNRZ7-Kulturen, die unter aeroben Bedingungen gezüchtet wurden, auf eine höhere Sauerstoffhemmung zurück.

Unter aeroben Bedingungen ohne Schütteln beobachten wir eine allmähliche Abnahme der Ausbeute im Bereich der Lysozymkonzentration von 2 bis 10 µg ml−1. Wie oben, Wir erklären dies durch Sedimentation von Bakterienketten in die weniger sauerstoffhaltige Zone am Boden der Platten. Im Schüttler beobachten wir diese Abnahme des OD nicht, da die Sedimentation verhindert wird. Unter anaeroben Bedingungen kann der Anstieg der OD im gleichen Bereich der Lysozymkonzentrationen durch verminderte Sedimentation und anschließende gleichmäßigere Verteilung der Bakterien im Medium erklärt werden. Mikroskopische Beobachtungen stimmen mit dieser Argumentation überein, da die Länge der CNRZ7-Ketten in Medium ohne Lysozym mehr als 100 Zellen beträgt und allmählich auf einen Durchschnittswert von 2 abnimmt, wenn die Lysozymkonzentration auf 10 µg ml−1 erhöht wurde. Die Kettenlängen waren unter aeroben und anaeroben Bedingungen ungefähr gleich.

Die obigen Ergebnisse lassen vermuten, dass anaerobe Bakterien Wachstumsvorteile haben können, die von ihrer Fähigkeit abhängen, Ketten zu bilden.

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Wir haben gezeigt, dass Muramidase Wechselwirkungen zwischen L. lactis MG1363 und S. thermophilus CNRZ7 vermittelt und die Kettenlänge ‚in trans‘ bestimmen kann. Wie allgemein kann diese Art von Verhalten sein? Lyophilisierte Micrococcus lysodeikticus-Zellen werden routinemäßig als Indikator für autolytische Aktivität verwendet. Ergebnisse verschiedener Laboratorien zeigen, dass Autolysine verschiedener Bakterienarten, z.B. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus oder Staphylococcus aureus können Peptidoglycan von Mikrokokken zerstören. Auch andere bakterielle Peptidoglycanhydrolasen, wie Amidase oder Glucosaminidase, die Hauptautolysine von Bacillus subtilis sind, können Peptidoglycan zerstören . Diese Daten legen nahe, dass Interaktionen über Autolysine, die zu Kettenunterbrechungen führen, zwischen zahlreichen Bakterienarten bestehen können.

Eine einfache Erklärung für die beobachtete Unterbrechung der Streptokokkenketten ist, dass Peptidoglycan direkt durch die L. lactis Muramidase hydrolysiert wird, die von MG1363 in das Medium freigesetzt wird. Zymogramme wurden durchgeführt, um die Menge an hydrolytischer Aktivität in MG1363-Überständen abzuschätzen. Unter Verwendung von Mikrokokkenzellen als Substrat schätzten wir die Menge an AcmA-Aktivität, um ungefähr der für 0,1 µg Lysozym beobachteten zu entsprechen (Ergebnisse nicht gezeigt). Andere Faktoren, wie Proteinasen, können bei diesen Wechselwirkungen ebenfalls eine Rolle spielen: es wurde gezeigt, dass die Einführung von klonierten Zellwand-verankerten Proteinase-Gen in MG1363acmAΔ1 Mutante führt zu einer Verringerung der Kettengröße . Es wurde berichtet, dass die Lactokokken-HtrA-Protease am Abbau der AcmA-Muramidase beteiligt ist , was auch die Kettenlänge beeinflussen kann.

Wir zeigten eine effiziente Streptokokken-Kettenunterbrechungsaktivität durch phylogenetisch unterschiedliche, aber dennoch eng verwandte Bakterien L. lactis ssp. cremoris MG1363 und L. lactis ssp. in : lactis IL1403 . Interessant, phylogenetisch entfernter L. die Helveticus-Stämme CNRZ10940 und CNRZ1102, die als Autolysin-positiv beschrieben wurden, konnten die Ketten von MG1363acmAΔ1 oder CNRZ7 unter den oben beschriebenen Bedingungen nicht unterbrechen. Dies kann durch Unterschiede in der Peptidoglycanzusammensetzung und Spezifität von Peptidoglycanhydrolasen phylogenetisch unterschiedlicher Bakterien erklärt werden .

Die hier beschriebene Rolle der Muramidasen kann in gemischten Bakterienpopulationen unter natürlichen Bedingungen eine wichtige Rolle spielen. Wir haben gezeigt, dass die Existenz von Bakterien im Einzelzellzustand versus Ketten in einigen Fällen Konsequenzen für das Wachstum haben kann. Die Zerstörung von Ketten und Änderungen der Sedimentationsgeschwindigkeit ist nur ein Beispiel für mögliche Auswirkungen der interzellulären Wirkung von Peptidoglycanhydrolasen. Die partielle Hydrolyse der bakteriellen Zellwand kann auch andere Auswirkungen haben. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass Autolysine die primäre Anheftung von Staphylococcus epidermidis an feste Oberflächen beeinflussen . In Anbetracht unserer Ergebnisse ist es möglich, dass Muramidasen einer Spezies die Bildung von Biofilmen einer anderen Spezies innerhalb einer gemischten Gemeinschaft beeinflussen können.

Danksagung

Wir danken A. Gruss für die kritische Lektüre des Manuskripts, G. Buist für das Geschenk des Stammes MG1363acmAΔ1, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik für anregende Diskussionen, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber für die Hilfe bei der Fotoarbeit und M. Cavaroc für technische Hilfe. Wir danken P. Tailliez für das Geschenk spezifischer Fluoreszenzsonden.