Effets d’une muramidase sur une communauté bactérienne mixte

Résumé

Dans les communautés bactériennes, une bactérie peut influencer la croissance des autres membres de la population. Ces interactions peuvent être basées sur des facteurs nutritionnels ou peuvent se produire via des molécules de signalisation bactériennes libérées dans le milieu. Nous présentons un exemple, montrant qu’en plus des moyens d’interactions ci-dessus, les muramidases, des enzymes qui clivent spécifiquement les chaînes peptidoglycanes, peuvent également médier les interactions entre les bactéries. En utilisant l’hybridation in situ fluorescente, nous démontrons que la Lactococcus lactis muramidase AcmA peut hydrolyser la paroi cellulaire de Streptococcus thermophilus, sans affecter la viabilité. Cette activité intercellulaire de la muramidase lactococcique entraîne une perturbation de la chaîne des streptocoques in vivo. Nos données nous amènent à proposer que les chaînes peuvent donner des avantages de croissance aux streptocoques en conditions aérobies.

1 Introduction

Il est généralement admis qu’une bactérie vivant dans des communautés bactériennes complexes peut affecter la croissance de ses voisines. Les interactions entre les bactéries peuvent être réalisées sur une base nutritive. La communication intercellulaire se produit également par libération dans le milieu de différentes classes de molécules de signalisation, permettant ainsi aux bactéries de réguler une grande variété de fonctions, telles que l’autoagrégation, la détection du quorum, la différenciation bactérienne et le transfert de plasmides conjugués. Des molécules de signalisation ont été identifiées dans les bactéries à Gram positif et à Gram négatif (pour examen, voir).

Nous présentons ici des résultats montrant que la muramidase, l’enzyme bactérienne qui clive spécifiquement le peptidoglycane, peut également médier les interactions entre les bactéries.

Les bactéries peuvent produire les quatre types d’enzymes suivants qui hydrolysent les peptidoglycanes de la paroi cellulaire: les muramidases, qui sont illustrées par des enzymes de type lysozyme, des glucosaminidases, des amidases et certaines peptidases. L’activité peptidoglycane hydrolase de l’un de ces quatre types d’enzymes peut provoquer une autolyse. Les peptidoglycanes hydrolases sont également impliqués dans des processus tels que l’épaississement et le renouvellement des peptidoglycanes, la division cellulaire, la compétence cellulaire pour la transformation de l’ADN, la sporulation et la motilité bactérienne.

Lactococcus lactis ssp. la souche modèle de cremoris MG1363, traitée de plasmides et de phages, ne contenait que l’activité de la muramidase codée par le gène acmA. Cette muramidase est responsable de l’autolyse des lactocoques. La protéine AcmA mature est présente à la fois dans le milieu et attachée à la surface cellulaire via ses répétitions C-terminales. Le gène acmA a été cloné et séquencé, et un mutant de délétion, MG1363acmAΔ1, a été construit; le mutant forme de longues chaînes, montrant ainsi une implication de la muramidase dans la séparation des cellules lactococciques. Les chaînes du mutant acmA peuvent être perturbées par l’ajout d’un milieu de culture épuisé de type sauvage MG1363.

Dans ce travail, nous avons examiné la capacité de l’AcmA muramidase de L. lactis à agir sur les streptocoques dans une population bactérienne mixte.

2 Matériaux et méthodes

2.1 Souches bactériennes

2.2 Conditions de croissance

Des expériences ont été réalisées en milieu M17glu (bouillon M17, additionné de 0,5% de glucose). La température de croissance était de 30 ° C pour les lactocoques et de 42 ° C pour les streptocoques et les lactobacilles. Les chaînes bactériennes ont été perturbées par l’ajout de 0,01 mg ml−1 de lysozyme (Boehringer, Heilderberg, Allemagne) dans le milieu, sauf indication contraire. Des conditions anaérobies ont été créées dans des bocaux avec des sachets anaérobies Genbox (Biomérieux SA, Marcy l’Etoile, France). Les cultures cultivées en milieu liquide en plaques ont été maintenues sur un agitateur (Apelex, Massy, France, 25 balançoires min-1) pour assurer l’aération et prévenir la sédimentation bactérienne.

Pour les études de sédimentation, des bactéries ont été cultivées dans des cuvettes spectrophotométriques en plastique de 1,5 ml (Marque, Wertheim, Allemagne). Des dilutions appropriées de lactocoques ont été inoculées en milieu liquide ou semi-liquide fondu (M17glu avec gélose à 0,0035%, Difco, Detroit, USA). Après une croissance nocturne, des photographies de cuvettes ont été prises à l’aide d’un film Sensia 400 (Fuji, Tokyo, Japon).

2.3 Hybridation in situ fluorescente (FISH), microscopie et analyse d’images

Mélanges cellulaires spécifiquement colorés selon la technique FISH, avec des sondes spécifiques pour les lactocoques (LAC, marqué à la fluorescéine, vert) et pour les streptocoques (STR, marqué à la rhodamine, rouge ; P. Tailliez, inédit). Après hybridation, les images ont été capturées à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Nikon, Tokyo, Japon) et du système d’analyse d’images Visiolab 1000 (Biocom, Les Ulis, France) et traitées avec le programme Adobe Illustrator 7.0 (Édimbourg, Écosse).

Pour estimer la longueur de la chaîne bactérienne, des cellules ont été colorées avec 2,5 µg ml−1 de DAPI (4,6-diamino-2-phénylindole, Sigma, St. Louis, USA), des images ont été capturées avec Visiolab 1000 et la longueur de la chaîne a été comptée manuellement.

3 Résultats

3.1 Perturbation des chaînes streptococciques par la muramidase lactococcique AcmA

Nous avons considéré qu’en plus d’affecter les cellules de la même espèce, la muramidase MG1363 pourrait également influencer la formation de chaînes d’autres espèces dans des populations mixtes. Pour tester cela, nous avons utilisé des souches lactococciques MG1363 et son dérivé acmA, ainsi qu’une souche de S. thermophilus formant une chaîne CNRZ7. Nous avons mélangé une culture nocturne des streptocoques avec une culture lactococcique en phase exponentielle. Après une incubation de 3 h à 30°C, les mélanges cellulaires ont été fixés et colorés spécifiquement à l’aide de la technique FISH.

Dans le mélange de streptocoques avec MG1363, il ne reste aucune chaîne streptococcique après 3 h d’incubation. En revanche, dans le mélange de CNRZ7 et de MG1363acmAΔ1, des chaînes des deux souches sont visibles (Fig. 1). Comme MG1363acmAΔ1 et MG1363 sont isogènes et ne diffèrent que par la présence d’AcmA, nous concluons que l’ACMA muramidase est responsable de la perturbation des chaînes streptococciques. La souche d’une autre sous-espèce lactococcique, L. lactis ssp. lactis IL1403, a également pu perturber les chaînes streptococciques dans des expériences similaires. Dans ces cultures mixtes, la muramidase lactococcique agit comme un médiateur des interactions entre deux espèces, chacune d’un genre différent, de sorte que la muramidase d’une espèce peut affecter la capacité de formation de chaînes d’une autre espèce.

Nous avons demandé si la muramidase lactococcique affectait la viabilité des streptocoques dans ces conditions. Des cellules CNRZ7 en phase de croissance exponentielle ou stationnaire ont été mises en suspension dans des surnageants de culture de MG1363 et MG1363acmAΔ1. Aucune différence de viabilité n’a été observée après 4 h d’incubation, comme en témoigne le placage ou la mesure de la DO.

3.2 Influence des chaînes bactériennes sur la sédimentation

Les bactéries présentes sous forme de chaînes sédimentent plus rapidement que les cellules libres. Lorsque les streptocoques formant une chaîne (Fig. 2a), ou L. lactis MG1363acmAΔ1 (Fig. 2c) sont cultivés pendant la nuit en milieu liquide, ils forment un sédiment dans le réceptacle. La souche MG1363 ne formant pas de chaîne ne sédimente pas dans les mêmes conditions (Fig. 2e). En utilisant de faibles concentrations non bactéricides de lysozyme, nous pourrions convertir les chaînes de CNRZ7 et du mutant MG1363acmAΔ1 à l’état unicellulaire; dans ces conditions, leur sédimentation est réduite (Fig. 2b et d, respectivement). En milieu semi-liquide, on distingue des colonies de souches MG1363 et MG1363acmAΔ1. La souche sauvage forme des colonies striées (Fig. 2h), tout comme la souche MG1363acmAΔ1 cultivée avec du lysozyme (Fig. 2g). Ces schémas de croissance indiquent que les cellules séparées ont la capacité, bien que limitée, de sédimenter en milieu semi-liquide. En revanche, MG1363acmAΔ1 forme des colonies rondes (Fig. 2f), ce qui peut indiquer que les longues chaînes empêchent la sédimentation dans ce milieu.

Ces exemples montrent que la distribution des bactéries en milieu liquide et semi-liquide est influencée par la capacité des cellules à former des chaînes.

3.3 Avantages de croissance de S. thermophilus CNRZ7 en raison de la capacité de formation de chaînes

Nous avons utilisé la souche CNRZ7 de S. thermophilus pour tester comment la capacité de former des chaînes influence la croissance des bactéries. Les streptocoques sont considérés comme des anaérobies facultatifs. Des cultures nocturnes de ces souches ont été diluées 1000 fois dans un milieu liquide frais et les cultures ont été divisées en deux. Du lysozyme (0,01 mg ml-1) a été ajouté à l’une des aliquotes, et chaque culture a ensuite été répartie en six tubes et six plaques de pétri (25 ml par récipient). Les échantillons ont été incubés sans agitation pendant une nuit à 42°C. Un autre ensemble d’échantillons a été incubé dans des conditions anaérobies. L’OD600 de tous les échantillons a été mesuré après dilution 10 fois dans le même milieu auquel du lysozyme (0,01 mg ml−1) a été ajouté pour perturber les chaînes. Les résultats indiquent (tableau 1) que la croissance des cellules en chaînes confère un avantage aux streptocoques en milieu aéré. Dans tous les cas sauf un, le rendement bactérien est plus élevé lorsque les cellules sont cultivées sur des plaques par rapport aux tubes. Une meilleure croissance dans les plaques contenant du milieu liquide peut s’expliquer par une répartition plus uniforme des cellules sur les plaques par rapport aux tubes, ce qui pourrait ainsi permettre un meilleur accès aux nutriments. L’exception concerne les streptocoques cultivés en plaques dans des conditions aérobies avec du lysozyme. Dans ce cas, nous avons observé une inhibition de la croissance par rapport aux conditions anaérobies, avec un rapport OD600 anaérobie: aérobie de 1,4. Lorsque les cellules ont été cultivées dans des tubes, les effets de l’aération ont été réduits et le taux de croissance était de 1,1. Un rapport similaire a été obtenu lorsque les cellules ont été cultivées en milieu sans lysozyme (tableau 1).

L’inhibition de la croissance streptococcique dans des conditions aérobies avec le lysozyme peut s’expliquer par la perturbation des chaînes en cellules uniques et par conséquent par une sédimentation plus lente. Il a été rapporté que la croissance des anaérobies en milieu liquide sans agitation est inhibée à environ 0,5 cm de la surface, en raison de la pénétration de l’oxygène dans le milieu. En l’absence de lysozyme, CNRZ7 forme des chaînes et des sédiments au fond du récipient, en dessous de la zone riche en oxygène; dans ce cas, l’OD600 sur les plaques est légèrement supérieur à celui des tubes. En revanche, lorsque les bactéries sont cultivées en milieu avec du lysozyme, elles ne forment pas de longues chaînes, comme vérifié par microscopie et sédimentent plus lentement; dans ce cas, il reste plus de cellules dans la partie supérieure du vaisseau, c’est-à-dire dans la zone inhibitrice. Comme la surface de la zone d’inhibition est plus grande sur les plaques que dans les tubes, il s’ensuit que la croissance sur les plaques est plus inhibée que la croissance dans les tubes. Les valeurs de densité optique dans les plaques et les tubes ont confirmé ce raisonnement (tableau 1).

Une autre explication de la faible croissance aérobie des streptocoques en présence de lysozyme pourrait être que les cellules sont plus sensibles au lysozyme dans des conditions aérobies ou plus sensibles à l’oxygène en présence de lysozyme. Pour répondre à cette question, CNRZ7 a été cultivé pendant la nuit en plaques comme dans l’expérience précédente, mais avec des concentrations différentes de lysozyme. En parallèle, un ensemble de plaques a été maintenu dans des conditions d’agitation pour empêcher la sédimentation et augmenter l’aération. Comme présenté à la Fig. 3, le rendement des bactéries cultivées avec agitation n’a pas diminué en fonction de la concentration en lysozyme. Cela signifie que les streptocoques ne deviennent pas plus sensibles à l’oxygène lorsque du lysozyme est ajouté. Nous attribuons un rendement plus faible des cultures de CNRZ7 cultivées dans des conditions aérobies à une inhibition plus élevée de l’oxygène.

En conditions aérobies sans agitation, nous observons une diminution progressive du rendement dans la gamme de concentration en lysozyme de 2 à 10 µg ml−1. Comme ci-dessus, nous l’expliquons par la sédimentation des chaînes bactériennes vers la zone moins oxygénée au fond des plaques. Dans le shaker, nous n’observons pas cette diminution de la DO puisque la sédimentation est empêchée. Dans des conditions anaérobies, l’augmentation de la DO dans la même gamme de concentrations de lysozyme peut s’expliquer par une sédimentation réduite et une distribution plus uniforme des bactéries dans le milieu. Les observations microscopiques sont conformes à ce raisonnement, car la longueur des chaînes CNRZ7 est supérieure à 100 cellules en milieu sans lysozyme et diminue progressivement jusqu’à une valeur moyenne de 2 lorsque la concentration en lysozyme est augmentée à 10 µg ml−1. Les longueurs de chaîne étaient à peu près les mêmes dans des conditions aérobies et anaérobies.

Les résultats ci-dessus nous amènent à proposer que les bactéries anaérobies peuvent avoir des avantages de croissance qui dépendent de leur capacité à former des chaînes.

4 Discussion

Nous avons montré que la muramidase médie les interactions entre L. lactis MG1363 et S. thermophilus CNRZ7 et peut déterminer la longueur de la chaîne « in trans ». À quel point ce genre de comportement peut-il être général? Les cellules lyophilisées de Micrococcus lysodeikticus sont couramment utilisées comme indicateur de l’activité autolytique. Les résultats de différents laboratoires montrent que les autolysines de différentes espèces bactériennes, p.ex. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus ou Staphylococcus aureus, peuvent détruire le peptidoglycane des microcoques. En outre, d’autres peptidoglycanes hydrolases bactériennes, comme l’amidase ou la glucosaminidase, qui sont des autolysines majeures de Bacillus subtilis, peuvent détruire le peptidoglycane. Ces données suggèrent que des interactions via des autolysines, qui entraînent une perturbation de la chaîne, peuvent exister entre de nombreuses espèces bactériennes.

Une explication simple de la perturbation observée des chaînes streptococciques est que le peptidoglycane est directement hydrolysé par la muramidase de L. lactis qui est libérée par MG1363 dans le milieu. Des zymogrammes ont été réalisés pour estimer la quantité d’activité hydrolytique présente dans les surnageants MG1363. En utilisant des cellules micrococciques comme substrat, nous avons estimé que la quantité d’activité AcmA correspondait approximativement à celle observée pour 0,1 µg de lysozyme (résultats non présentés). D’autres facteurs, tels que les protéinases, peuvent également jouer un rôle dans ces interactions: il a été démontré que l’introduction d’un gène de protéinase ancré dans la paroi cellulaire clonée dans le mutant MG1363acmAΔ1 entraîne une réduction de la taille de la chaîne. La protéase HtrA lactococcique serait impliquée dans la dégradation de l’AcmA muramidase, ce qui pourrait également influencer la longueur de la chaîne.

Nous avons démontré une activité efficace de perturbation de la chaîne streptococcique par des bactéries phylogénétiquement différentes mais néanmoins étroitement apparentées L. lactis ssp. cremoris MG1363 et L. lactis ssp. lactis IL1403. Fait intéressant, phylogénétiquement plus éloigné L. les souches d’helveticus CNRZ10940 et CNRZ1102, décrites comme autolysines positives, n’ont pas pu perturber les chaînes de MG1363acmAΔ1 ou CNRZ7 dans les conditions décrites ci-dessus. Cela peut s’expliquer par des différences dans la composition des peptidoglycanes et la spécificité des peptidoglycanes hydrolases de bactéries phylogénétiquement différentes.

Le rôle des muramidases décrites ici peut jouer un rôle important dans des populations bactériennes mixtes dans des conditions naturelles. Nous avons montré que l’existence de bactéries à l’état unicellulaire par rapport aux chaînes peut dans certains cas avoir des conséquences sur la croissance. La destruction des chaînes et les changements de vitesse de sédimentation ne sont qu’un exemple des effets possibles de l’action intercellulaire des peptidoglycanes hydrolases. L’hydrolyse partielle de la paroi cellulaire bactérienne peut également avoir d’autres effets. Par exemple, il a été récemment démontré que les autolysines affectent la fixation primaire de Staphylococcus epidermidis aux surfaces solides. Au vu de nos résultats, il est possible que les muramidases d’une espèce puissent influencer la formation de biofilms d’une autre espèce au sein d’une communauté mixte.

Remerciements

Nous remercions A. Gruss pour la lecture critique du manuscrit, G. Buist pour le don de la souche MG1363acmAΔ1, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik pour les discussions stimulantes, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber pour l’aide au travail photo et M. Cavaroc pour l’aide technique. Nous remercions P. Tailliez pour le don de sondes fluorescentes spécifiques.