Hemos construido previamente una cepa de E. coli que es capaz de producir itaconato en condiciones aeróbicas al sobreexpresar la cis-aconitato descarboxilasa (cadA) de A. terreus. El flujo a itaconato se mejoró al sobreexpresar los genes que codifican la citrato sintasa (gltA) y la aconitasa (acnA) de C. glutamicum y eliminar los genes que codifican la fosfotransacetilasa (pta) y la lactato deshidrogenasa (ldhA) (Vuoristo et al. 2015). En condiciones anaeróbicas, E. coli utiliza una fermentación ácida mixta en la que se sintetizan varios productos como acetato, succinato, etanol, formiato, lactato, hidrógeno y dióxido de carbono (Clark 1989). Los flujos a estos productos y a la biomasa en E. coli se combinan de tal manera que se mantiene un equilibrio redox. La producción de itaconato, así como la producción de acetato y piruvato, resulta en la reducción de cofactores, que se puede equilibrar con la coproducción de succinato y/o etanol. En este estudio investigamos si es posible realizar la producción anaeróbica de itaconato en E. coli.
Las cepas de E. coli que se desarrollaron previamente para la producción aeróbica de itaconato se cultivaron en condiciones anaeróbicas. La expresión de cadA en E. coli BW25113 (DE3) no fue suficiente para iniciar la producción de itaconatos. La citrato sintasa de E. coli está controlando el flujo a través del ciclo del ácido cítrico porque está inhibida alostéricamente por las altas concentraciones de NADH que ocurren en condiciones anaeróbicas, y esto puede haber impedido la producción de itaconato. La citrato sintasa de C. glutamicum (GltA) no se ve afectada por tal retroalimentación negativa (Eikmanns et al. 1994). De hecho, la coexpresión de acnA y gltA de C. glutamicum en E. coli BW25113 (DE3) tuvo un efecto positivo en la producción de itaconato, ya que resultó en la producción de itaconato, pero los títulos fueron bajos.
Dado que el título de itaconato y el rendimiento fueron bajos, es importante evitar la formación innecesaria de subproductos. La eliminación de ldhA suprimió por completo la producción de lactato, pero la eliminación de pta no resultó en una reducción significativa de la producción de acetato. Se hizo una observación similar en condiciones aeróbicas(Vuoristo et al. 2015) y confirma la existencia de vías alternativas para la producción de acetato.
La expresión de cadA en E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA ya era suficiente para evocar la producción de itaconato, pero la cepa también acumuló piruvato y citrato, lo que indica que la vía hacia el itaconato estaba restringida. La acumulación de piruvato es probablemente causada por un desequilibrio redox. Para mantener el equilibrio redox, E. coli BW25113 (DE3) Δptaδdha tiene que producir itaconato junto con etanol y/o succinato. Cuando el flujo a itaconato es demasiado bajo en comparación con los flujos a etanol y succinato, las cepas se limitarán al NADH, lo que resultó en la acumulación de piruvato. La expresión adicional de gltA y acnA de C. glutamicum estimuló fuertemente la producción de itaconato y redujo la cantidad de piruvato que se formó, lo que resultó en un título de itaconato 8 veces mayor.
Anteriormente demostramos que la expresión heteróloga de cadA conduce a la formación de cuerpos de inclusión(Vuoristo et al. 2015). Estrategias para aumentar la solubilidad de CadA en E. coli, como la evolución de proteínas dirigida por laboratorio (Yuan et al. 2005) o armonización de codones (Angov et al. 2008) es probable que aumenten el flujo de aconitato. Otra opción es que la concentración intracelular de itaconato y la falta de capacidad de transporte podrían convertirse en limitantes de velocidad, lo que también fue propuesto por Okamoto et al. (2014). DauA se caracterizó como el principal transportador de succinatos en E. coli, pero se demostró que transporta también otros ácidos dicarboxílicos a pH 7 (Karinou et al. 2013), lo que sugiere que la sobreexpresión de dauA puede impulsar la exportación de itaconatos. Recientemente se han caracterizado varios transportadores de itaconatos putativos en especies de Aspergillus (Li et al. 2011; van der Straat et al. 2014), pero su funcionalidad en E. coli no ha sido probada.
Inesperadamente, se produjo glutamato en cultivos de E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA en los que se expresaron gltA y acnA de C. glutamicum. El método UPLC utilizado para determinar el glutamato también reveló que se produjeron cantidades significativas de alanina (1,5–3% C-mol) en todas las cepas de E. coli. Al parecer, la alanina es un producto de fermentación estándar de esta cepa de E. coli. La búsqueda en la literatura no reveló otros estudios en los que se encontró alanina como producto de fermentación estándar de E. coli.
Tanto la síntesis de itaconato como de glutamato compiten por los mismos productos intermedios. Por lo tanto, para aumentar el flujo a itaconato, es necesario reprimir la producción de glutamato. Los auxótrofos de glutamato de E. coli se han realizado eliminando los genes que codifican la citrato sintasa (gltA) (Mainguet et al. 2013), aconitasa (acnA) (Gruer et al. 1997) o isocitrato deshidrogenasa (icd) (Lakshmi y Helling 1976). GltA y acnA participan en la producción de itaconatos y, por lo tanto, son candidatos inadecuados. Se sabe que los knockouts de DAI y acnA son inestables en condiciones aeróbicas, ya que conducen a la inactivación de gltA, posiblemente debido a un efecto tóxico del citrato de acumulación intracelular (Gruer et al. 1997). Aun así, Gruer et al. (1997) mostraron que los knockouts de acnA eran estables en condiciones anaeróbicas, lo que sugiere que se acumula menos citrato en condiciones anaeróbicas, posiblemente debido a la regulación de la actividad de GltA por NADH. Introducción de la citrato sintasa insensible al NADH de C. glutamicum en E. coli BW25113 (DE3) p pta ld ldhA may icd puede, por lo tanto, no ser factible. De hecho, los intentos de expresar los genes de pKV-CGA en la cepa no tuvieron éxito. Incluso la expresión de pKV-C, que solo contiene cadA, resultó en la pérdida de una parte de cadA durante el crecimiento, lo que sugiere que la inestabilidad de los knockouts del dai también puede ser causada por la acumulación de altas concentraciones intracelulares de itaconato.
En un estudio reciente (Okamoto et al. 2014), CadA se expresó con éxito en la cepa ∆icd cuando se cultivó en medio LB en condiciones aeróbicas. La sobreexpresión de la aconitasa (acnB) junto con cadA en la cepa ERS icd condujo a una mayor producción de itaconato (4,34 g/L). Sin embargo, un medio de crecimiento complejo como LB, que parecía estabilizar la expresión de cadA en un fondo de DAI de∆, no es preferido para la producción de productos químicos a granel debido a su alto precio. Además, la cepa ERS icd acumuló una cantidad sustancial de acetato sin una deleción en las vías metabólicas involucradas en el metabolismo del acetato, como la pta, y los autores recomendaron inactivar las vías formadoras de acetato. En otro estudio, la actividad del Dai de C. el glutamicum se redujo intercambiando el codón de inicio ATG por GTG o TTG, que junto con una expresión heteróloga de CadA resultó en 60 mm de itaconato (Otten et al. 2015).
Como la producción de glutamato depende de la disponibilidad de nitrógeno en el medio, se probó una estrategia alternativa para disminuir la producción de glutamato mediante el cultivo de células en medio limitado por nitrógeno. Esto mejoró la producción de itaconato hasta un 5,4% Cmol con E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA pKV-CGA. Mejorar el flujo de aconitato a itaconato probablemente reduciría aún más la cantidad de producción de glutamato.
Escherichia coli tiene varias características interesantes para la producción anaeróbica de itaconato: Es uno de los pocos microorganismos industriales que puede crecer en condiciones anaeróbicas. La acetil-CoA, un precursor del itaconato, es un metabolito central en los procesos de disimulación en E. coli, lo que no es el caso de eucariotas como Saccharomyces cerevisiae, aunque varios grupos están tratando de cambiar esto (Kozak et al. 2014; Lian et al. 2014). E. coli convierte el piruvato en acetil-CoA y el formiato por piruvato-formiato liasa en condiciones anaeróbicas. El formiato se puede dividir posteriormente en H2 y CO2 valiosos. Otras cepas industriales que son capaces de crecer en condiciones anaeróbicas, como S. cerevisiae y bacterias de ácido láctico, utilizan piruvato deshidrogenasa dependiente de NAD para sintetizar acetil-CoA, que genera NADH adicional y, por lo tanto, requiere regeneración cofactor adicional a costa del sustrato.
La producción microbiana de ácidos orgánicos es estudiada por muchos grupos . La adición de base (cal) es necesaria cuando se producen ácidos orgánicos a pH neutro. Durante el procesamiento posterior, la sal ácida orgánica tiene que convertirse en ácido orgánico, lo que generalmente se hace agregando ácido sulfúrico. Esto da lugar a la producción de grandes cantidades de sales (yeso). Un enfoque alternativo es producir el ácido orgánico a un pH bajo. E. coli no puede crecer a valores de pH bajos y, por lo tanto, la producción de ácido orgánico con E. coli solo se puede hacer a valores de pH neutro.
Este estudio muestra que es posible sintetizar itaconato anaeróbicamente mediante el uso de la vía ácida mixta de E. coli, en la que la síntesis de etanol/H2 y succinato regeneran NAD. El etanol / H2 parece ser el mejor conjunto de coproductos para aplicaciones industriales, ya que estos productos se pueden separar simplemente en función de sus temperaturas de ebullición y comercializarse fácilmente como productos químicos a granel. El itaconato y el succinato son más difíciles de separar porque ambos son ácidos dicarboxílicos con una columna vertebral C4. Además, pueden copolimerizarse, lo que tendrá un impacto en las propiedades del polímero. Eliminar la fumarato reductasa (frd) es una de las soluciones obvias para prevenir la formación de succinatos (Zhou et al. 2006).
Esta es la primera vez que se notificó la producción anaeróbica de itaconato a partir de glucosa para E. coli. Los rendimientos y la productividad observados siguen siendo modestos. Eliminar las vías de acceso a los principales subproductos como el glutamato, el succinato y el acetato, y mejorar la vía entre el piruvato y el itaconato es, por lo tanto, crucial para obtener un proceso de producción anaeróbica rentable para el ácido itacónico.