Effects of a muramidase on a mixed bacterial community

Abstract

in bacterial communities one can influence the growth of other members of the population. Nämä yhteisvaikutukset voivat perustua ravitsemuksellisiin tekijöihin tai ne voivat tapahtua väliaineessa vapautuvien bakteerien signalointimolekyylien välityksellä. Esitämme esimerkin, joka osoittaa, että edellä mainittujen vuorovaikutustapojen lisäksi myös muramidaasit, entsyymit, jotka erityisesti hajottavat peptidoglykaaniketjuja, voivat välittää bakteerien välisiä vuorovaikutuksia. Käyttämällä fluoresoivaa in situ-hybridisaatiota osoitamme, että Lactococcus lactis muramidase AcmA voi hydrolysoida Streptococcus thermophilus-bakteerin soluseinän vaikuttamatta elinkelpoisuuteen. Tämä laktokokkimuramidaasin solunvälinen aktiivisuus aiheuttaa streptokokien ketjuhäiriöitä in vivo. Tietojemme perusteella voimme esittää, että ketjut voivat antaa kasvuhyötyä streptokokeille aerobisissa olosuhteissa.

1 Johdanto

on yleisesti hyväksytty, että monimutkaisissa bakteeriyhteisöissä elävä bakteeri voi vaikuttaa naapureidensa kasvuun. Bakteerien väliset vuorovaikutukset voivat toteutua ravitsemuksellisesti . Solujenvälistä viestintää tapahtuu myös vapauttamalla väliaineeseen erilaisia signaalimolekyylejä, jolloin bakteerit voivat säädellä monenlaisia toimintoja, kuten autoaggregaatiota, quorum-aistimista, bakteerien erilaistumista ja konjugatiivisten plasmidien siirtoa. Signalointimolekyylejä on tunnistettu sekä Grampositiivisissa että Gramnegatiivisissa bakteereissa (tarkistettavaksi, katso ).

tässä esitetään tulokset, jotka osoittavat, että muramidaasi, bakteerientsyymi, joka erityisesti pilkkoo peptidoglykaania, voi myös välittää bakteerien välisiä vuorovaikutuksia.

bakteerit voivat tuottaa seuraavia neljää entsyymityyppiä, jotka hydrolysoivat soluseinän peptidoglykaania: muramidaasit, joista lysotsyymin kaltaiset entsyymit, glukosaminidaasit, amidaasit ja eräät peptidaasit ovat esimerkkejä. Minkä tahansa näistä neljästä entsyymityypistä peptidoglykaanihydrolaasiaktiivisuus voi aiheuttaa autolyysiä. Peptidoglykaanihydrolaasit osallistuvat myös prosesseihin, kuten peptidoglykaanin paksuuntumiseen ja kiertoon, solunjakautumiseen, solujen osaamiseen DNA-transformaatioon, sporulaatioon ja bakteerien liikkuvuuteen .

Lactococcus lactis ssp. plasmideista ja fageista kovetetun cremoris – mallin kannan MG1363 raportoitiin sisältävän vain acmA-geenin koodaamaa muramidaasiaktiivisuutta. Tämä muramidaasi aiheuttaa laktokokien autolyysiä . Kypsää Akma-proteiinia on sekä väliaineessa että kiinnittyneenä solun pintaan C-terminaalisen toistonsa kautta . AcmA-geeni kloonattiin ja sekvensoitiin, ja rakennettiin deleetiomutantti, Mg1363acmδ1; mutantti muodostaa pitkiä ketjuja, mikä osoittaa muramidaasin osuuden laktokokkisoluerotuksessa . ACMA-mutanttien ketjuja voidaan häiritä lisäämällä villin tyypin mg1363 käytettyä viljelyainetta .

tässä työssä selvitimme L. lactis – bakteerin Akma-muramidaasin kykyä toimia streptokokkeihin sekabakteerikannassa.

2 materiaalit ja menetelmät

2, 1 bakteerikannat

2.2 kasvuolosuhteet

kokeet tehtiin m17glu-kasvualustalla (M17-liemi, johon lisättiin 0, 5% glukoosia ). Kasvulämpötila oli laktokokilla 30°C ja streptokokilla ja laktobasilleilla 42°C. Bakteeriketjut häiriintyivät lisäämällä 0, 01 mg ml−1 lysotsyymiä (Boehringer, Heilderberg, Saksa) väliaineeseen, ellei toisin mainita. Anaerobiset olosuhteet luotiin purkkeihin Genbox Anaer-annospusseilla (Biomérieux SA, Marcy l ’ Etoile, Ranska). Levyissä nestemäisessä väliaineessa kasvatettuja viljelmiä ylläpidettiin ravistimessa (Apelex, Massy, Ranska, 25 keinut min-1) ilmastuksen aikaansaamiseksi ja bakteerien sedimentaation estämiseksi.

sedimentaatiotutkimuksissa bakteereita kasvatettiin muovisissa 1, 5 ml: n spektrofotometrikuveteissa (Brand, Wertheim, Saksa). Asianmukaiset lactokokkeja sisältävät laimennokset inokuloitiin nestemäiseen tai sulatettuun puolinesteettiseen väliaineeseen (M17glu, jossa 0, 0035% agar, Difco, Detroit, USA). Yön yli kestäneen kasvun jälkeen kuvetteista otettiin valokuvia Sensia 400-filmillä (Fuji, Tokio, Japani).

2.3 fluoresoiva in situ-hybridisaatio (kala), mikroskopia ja kuva-analyysi

Soluseokset , jotka on erityisesti värjätty KALATEKNIIKALLA, koettimilla, jotka ovat spesifisiä laktokokille (Lac, merkitty fluoreseiinilla, vihreällä) ja streptokokille (STR, merkitty rodamiinilla, punaisella; P. Tailliez, julkaisematon). Hybridisaation jälkeen kuvat otettiin epifluoresenssimikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani) ja Visilab 1000-kuvaanalyysijärjestelmällä (Biocom, Les Ulis, Ranska) ja käsiteltiin Adobe Illustrator 7.0-ohjelmalla (Edinburgh, Skotlanti).

bakteeriketjun pituuden arvioimiseksi solut värjättiin 2,5 µg ml−1 Dapi: lla (4,6-diamino-2-fenyyliindoli, Sigma, St. Louis, USA), kuvat otettiin Visilab 1000: lla ja ketjun pituus laskettiin manuaalisesti.

3 tulokset

3.1 laktokokkimuramidaasi ACMA: n aiheuttamat streptokokkiketjujen häiriöt

katsoimme, että saman lajin soluihin vaikuttamisen lisäksi mg1363-muramidaasi saattaa vaikuttaa myös muiden lajien ketjunmuodostukseen sekapopulaatiossa. Tätä testattaessa käytettiin laktokokkikantoja MG1363 ja sen acmA-johdannaista sekä ketjuuntuvaa S. thermophilus-kantaa CNRZ7. Sekoitimme streptokokkiviljelmän yhdessä yössä eksponentiaalisessa vaiheessa olevaan laktokokkiviljelmään. 3h-inkubaation jälkeen 30°C: ssa soluseokset vahvistettiin ja väritettiin erityisesti KALATEKNIIKALLA.

mg1363: n streptokokkiketjuja ei ole jäljellä 3 tunnin inkubaation jälkeen. Sen sijaan CNRZ7: n ja Mg1363acmδ1: n seoksessa on nähtävissä molempien kantojen ketjut (Kuva. 1). Koska Mg1363acmδ1 ja MG1363 ovat isogeenisiä ja eroavat toisistaan vain AcmA: n läsnä ollessa, voimme päätellä, että AcmA-muramidaasi on vastuussa streptokokkiketjujen häiriöistä. Kanta toisesta laktokokin alalajista, L. lactis ssp. lactis IL1403, pystyi myös häiritsemään streptokokkiketjuja vastaavissa kokeissa. Näissä sekaviljelmissä laktokokkimuramidaasi toimii kahden eri sukuun kuuluvan lajin välisten vuorovaikutusten välittäjänä siten, että yhden lajin muramidaasi voi vaikuttaa toisen lajin ketjunmuodostuskykyyn.

kysyimme, vaikuttaako laktokokkimuramidaasi streptokokkien elinkelpoisuuteen näissä olosuhteissa. Eksponentiaalisissa tai stationäärisissä kasvuvaiheissa olevat CNRZ7-solut suspendoitiin mg1363: n ja mg1363acmaδ1: n supernatanttiviljelmiin. Elinkelpoisuudessa ei havaittu eroja 4 tunnin inkubaation jälkeen, kun se arvioitiin pinnoituksella tai OD-mittauksella.

3.2 bakteeriketjujen vaikutus sedimentaatioon

bakteerit esiintyvät ketjusedimentissä nopeammin kuin vapaat solut. Ketjuuntuessaan streptokokit (Kuva. 2a)tai L. lactis Mg1363acmδ1 (Kuva. 2c) kasvatetaan yön yli nestemäisessä väliaineessa, ne muodostavat sedimentin astiaan. Ketjuuntumaton kanta MG1363 ei saostu samoissa olosuhteissa (Kuva. 2 e). Käyttämällä alhaisia lysotsyymin ei-bakterisidisia pitoisuuksia voisimme muuntaa CNRZ7: n ja MG1363acmAΔ1-mutantin ketjut yksisolutilaan; näissä olosuhteissa niiden sedimentaatio vähenee (Kuva. 2b ja d). Kantojen MG1363 ja Mg1363acmδ1 puolinesteisissä väliainepesäkkeissä voidaan erottaa. Villityypin kanta muodostaa juovayhdyskuntia (viikuna. 2h), samoin kuin lysotsyymillä kasvatettu mg1363acmδ1-Kanta (kuva. 2g). Nämä kasvumallit osoittavat, että erotetuilla soluilla on puolinesteessä oleva sedimentti, vaikka se onkin rajallinen. Sen sijaan mg1363acmδ1 muodostaa pyöreitä pesäkkeitä (Kuva. 2f), mikä voi viitata siihen, että pitkät ketjut estävät sedimentaation tässä väliaineessa.

nämä esimerkit osoittavat, että bakteerien jakautumiseen nesteessä ja puolinesteessä vaikuttaa solujen kyky muodostaa ketjuja.

3, 3 S: N Kasvuedut. thermophilus CNRZ7 ketjunmuodostuskyvyn

vuoksi testasimme S. thermophilus cnrz7-kannan avulla, miten kyky muodostaa ketjuja vaikuttaa bakteerien kasvuun. Streptokokkeja pidetään fakultatiivisina anaerobeina . Näiden kantojen yön yli kestäneet viljelmät laimennettiin 1000-kertaisiksi tuoreeseen nestemäiseen väliaineeseen, ja viljelmät jaettiin kahtia. Lysotsyymi (0,01 mg ml−1) lisättiin yhteen aliquotista, ja kukin viljelmä jaettiin edelleen kuuteen putkeen ja kuuteen Petri-levyyn (25 ml per astia). Näytteitä inkuboitiin ravistelematta yön yli 42°C: ssa. Toinen näytesarja inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa. Kaikkien näytteiden OD600 mitattiin 10-kertaisen laimennuksen jälkeen samassa väliaineessa, johon lysotsyymi (0, 01 mg ml−1) lisättiin häiritsemisketjuihin. Tulokset osoittavat (Taulukko 1), että solujen kasvu ketjuissa antaa streptokokeille edun ilmastetussa ympäristössä. Yhtä lukuun ottamatta kaikissa tapauksissa bakteerisaanto on suurempi, kun soluja kasvatetaan levyillä putkiin verrattuna. Nestemäistä väliainetta sisältävien levyjen parempi kasvu voidaan selittää solujen tasaisemmalla jakautumisella levyillä putkiin verrattuna, mikä voisi siten mahdollistaa suuremman ravintoaineiden saannin. Poikkeus koskee levyissä aerobisissa olosuhteissa lysotsyymillä kasvatettuja streptokokkeja. Tässä tapauksessa havaitsimme kasvun estymisen anaerobisiin olosuhteisiin verrattuna, anaerobisen: aerobisen OD600-suhteen ollessa 1,4. Kun soluja kasvatettiin putkiloissa, ilmastuksen vaikutukset vähenivät ja kasvusuhde oli 1,1. Vastaavanlainen suhde saatiin, kun soluja kasvatettiin väliaineessa ilman lysotsyymiä (Taulukko 1).

streptokokin kasvun estyminen aerobisissa olosuhteissa lysotsyymillä voi selittyä ketjujen hajoamisella yksittäissoluiksi ja siten hitaammalla sedimentaatiolla. Raportoitiin, että anaerobien kasvu nestemäisessä väliaineessa ilman ravistelua estyy noin 0,5 cm: n etäisyydelle pinnasta, koska happea tunkeutuu väliaineeseen . Lysotsyymin puuttuessa CNRZ7 muodostaa ketjuja ja sedimenttejä astian pohjalle happirikkaan vyöhykkeen alapuolelle; tällöin levyjen OD600 on hieman korkeampi kuin putkissa. Kun bakteerit sen sijaan kasvavat väliaineessa lysotsyymin avulla, ne eivät muodosta pitkiä ketjuja, mikä on varmistettu mikroskopialla ja sedimentillä hitaammin; tällöin astian yläosaan jää enemmän soluja, ts. estovyöhykkeellä. Koska inhibitioalueen pinta on levyillä suurempi kuin putkissa, tästä seuraa, että kasvu levyillä on estyneempää kuin kasvu putkissa. Levyjen ja putkien optisen tiheyden arvot vahvistivat tämän päättelyn (Taulukko 1).

vaihtoehtoinen selitys streptokokkien heikolle aerobiselle kasvulle lysotsyymin läsnä ollessa voi olla se, että solut ovat herkempiä lysotsyymille aerobisissa olosuhteissa tai herkempiä hapelle lysotsyymin läsnä ollessa. Tämän kysymyksen ratkaisemiseksi CNRZ7: ää kasvatettiin yhdessä yössä levyissä, kuten edellisessä kokeessa, mutta lysotsyymipitoisuuksissa oli eroja. Samanaikaisesti säilytettiin levysarjaa ravisteluolosuhteissa sedimentaation estämiseksi ja ilmastuksen lisäämiseksi. Kuten esitetty kuvassa. 3, ravistamalla kasvatettujen bakteerien tuotto ei vähentynyt lysotsyymipitoisuuden funktiona. Tämä tarkoittaa sitä, että streptokokit eivät herkisty hapelle, kun lysotsyymiä lisätään. Laskemme aerobisissa olosuhteissa kasvatettujen CNRZ7-viljelmien pienemmän tuoton korkeampaan hapen estoon.

aerobisissa olosuhteissa ilman ravistelua havaitsemme saannon vähittäisen vähenemisen lysotsyymipitoisuusalueella 2: sta 10 µg ml-1: een. Kuten edellä, selitämme tämän sedimentoimalla bakteeriketjuja vähemmän hapetetulle vyöhykkeelle levyjen alaosassa. Ravistimessa emme havaitse tätä yliannostuksen vähenemistä, koska sedimentaatio estyy. Anaerobisissa olosuhteissa OD: n kasvu samalla lysotsyymipitoisuusalueella voi selittyä alentuneella sedimentaatiolla ja siitä johtuvalla bakteerien tasaisemmalla jakautumisella väliaineeseen. Mikroskooppiset havainnot ovat tämän päättelyn mukaisia, koska CNRZ7−ketjujen pituus on yli 100 solua väliaineessa ilman lysotsyymiä ja pienenee vähitellen keskimääräiseen arvoon 2, kun lysotsyymipitoisuus nostettiin arvoon 10 µg ml-1. Ketjujen pituudet olivat suunnilleen samat aerobisissa ja anaerobisissa olosuhteissa.

edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että anaerobisilla bakteereilla voi olla kasvuetuja, jotka riippuvat niiden kyvystä muodostaa ketjuja.

4 Keskustelu

olemme osoittaneet, että muramidaasi välittää interaktioita L. lactis MG1363: n ja S. thermophilus CNRZ7: n välillä ja voi määrittää ketjun pituuden ”in trans”. Miten yleistä tällainen käytös voi olla? Kylmäkuivattuja Micrococcus lysodeikticus-soluja käytetään rutiininomaisesti autolyyttisen aktiivisuuden indikaattorina. Eri laboratorioiden tulokset osoittavat, että eri bakteerilajien autolysiinit, esim. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus tai Staphylococcus aureus voivat tuhota micrococcin peptidoglykaanin. Myös muut bakteerien peptidoglykaanihydrolaasit, kuten Amidaasi tai glukosaminidaasi, jotka ovat Bacillus subtilisin tärkeitä autolysiinejä, voivat tuhota peptidoglykaanin . Nämä tiedot viittaavat siihen, että useiden bakteerilajien välillä voi olla autolysiinien kautta syntyviä yhteisvaikutuksia, jotka aiheuttavat ketjuhäiriöitä.

yksinkertainen selitys havaituille streptokokkiketjujen häiriöille on se, että L. lactis-muramidaasi hydrolysoi peptidoglykaanin suoraan mg1363: n väliaineeseen vapauttaman L. lactis-muramidaasin vaikutuksesta. Tsymogrammit tehtiin hydrolyyttisen aktiivisuuden arvioimiseksi mg1363 supernatanteissa. Käyttämällä mikrokokkaalisoluja substraattina arvioimme AcmA: n aktiivisuuden määrän vastaavan suunnilleen 0,1 µg: n lysotsyymiä (tuloksia ei näy). Myös muut tekijät, kuten proteinaasit, voivat vaikuttaa näihin yhteisvaikutuksiin: osoitettiin, että kloonatun soluseinään ankkuroidun proteinaasigeenin käyttöönotto mg1363acmaδ1-mutantissa pienentää ketjun kokoa . Laktokokki-HtrA-proteaasin on raportoitu osallistuvan AcmA-muramidaasin hajoamiseen, mikä voi myös vaikuttaa ketjun pituuteen.

osoitimme fylogeneettisesti erilaisen, mutta kuitenkin läheistä sukua olevan bakteerin L. lactis ssp tehokkaan streptokokkiketjun häiritsevän toiminnan. cremoris MG1363 ja L. lactis ssp. lactis IL1403 . On kiinnostavaa, että fylogeneettisesti kaukaisempi L. autolysin-positiivisiksi kuvatut helveticus-kannat CNRZ10940 ja CNRZ1102 eivät pystyneet häiritsemään mg1363acmδ1: n tai CNRZ7: n ketjuja edellä kuvatuissa olosuhteissa. Tämä voidaan selittää fylogeneettisesti eri bakteerien peptidoglykaanikoostumuksen eroilla ja peptidoglykaanihydrolaasien spesifisyydellä .

tässä kuvatuilla muramidaaseilla voi olla merkittävä rooli sekalaisissa bakteeripopulaatioissa luonnollisissa olosuhteissa. Olemme osoittaneet, että bakteerien olemassaolo yksisoluisessa tilassa verrattuna ketjuihin voi joissakin tapauksissa vaikuttaa kasvuun. Ketjujen tuhoutuminen ja sedimentaationopeuden muutokset ovat vain yksi esimerkki peptidoglykaanihydrolaasien solunvälisen vaikutuksen mahdollisista vaikutuksista. Bakteerien soluseinän osittaisella hydrolyysillä voi olla myös muita vaikutuksia. Esimerkiksi äskettäin osoitettiin, että autolysiinit vaikuttavat Staphylococcus epidermidiksen ensisijaiseen kiinnittymiseen kiinteisiin pintoihin . Tulosten valossa on mahdollista, että yhden lajin muramidaasit voivat vaikuttaa toisen lajin biofilmien muodostumiseen sekayhteisössä.

kiitokset

Kiitämme A. Gruss käsikirjoituksen kriittiseen lukemiseen, G. Buist mg1363acmδ1-kannan lahjaan, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik keskustelujen herättämiseen, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber valokuvaustyöhön ja M. Cavaroc tekniseen apuun. Kiitämme P. Tailliezia loisteputkien lahjasta.