olemme aiemmin rakentaneet E. coli-kannan, joka pystyy tuottamaan itakonaattia aerobisissa olosuhteissa yliekspressoimalla A. terreuksesta peräisin olevaa cis-akonitaattidekarboksylaasia (cada). Vuo itakonaatiksi voimistui C. glutamicumin sitraattisyntaasia (gltA) ja akonitaasia (acnA) koodaavien geenien yliekspressointi ja fosfotransasetylaasia (pta) ja laktaattidehydrogenaasia (ldhA) koodaavien geenien poistaminen (Vuoristo et al. 2015). Anaerobisissa olosuhteissa E. coli käyttää sekahappokäymistä, jossa syntetisoidaan erilaisia tuotteita, kuten asetaattia, sukkinaattia, etanolia, formiaattia, laktaattia, vetyä ja hiilidioksidia (Clark 1989). Näihin tuotteisiin ja E. coli-bakteerin biomassaan liittyvät vuodot yhdistetään siten, että redox-tasapaino säilyy. Itakonaatin tuotanto sekä asetaatin ja pyruvaatin tuotanto—johtaa kofaktorin pelkistykseen, jota voidaan tasapainottaa sukkinaatin ja/tai etanolin yhteistuotannolla. Tässä tutkimuksessa selvitimme, onko mahdollista toteuttaa anaerobista itakonaatin tuotantoa E. colissa.
aiemmin itakonaatin aerobiseen tuotantoon kehitettyjä E. coli-kantoja viljeltiin anaerobisissa olosuhteissa. CadA: n ilmentyminen E. coli BW25113: ssa (DE3) ei riittänyt itakonaatin tuotannon aloittamiseen. E. coli-bakteerin sitraattisyntaasi ohjaa vuota sitruunahappokierron kautta, koska anaerobisissa olosuhteissa esiintyvät korkeat NADH-pitoisuudet estävät sitä allosteerisesti, ja tämä on saattanut estää itakonaatin tuotannon. Tällainen negatiivinen takaisinkytkentä ei vaikuta C. glutamicumin sitraattisyntaasiin (GltA) (Eikmanns et al. 1994). AcnA: n ja gltA: n yhteisilmaantumisella C. glutamicumista E. coli BW25113: ssa (DE3) oli positiivinen vaikutus itakonaatin tuotantoon, koska se johti itakonaatin tuotantoon, mutta tiitterit olivat alhaiset.
koska itakonaattititteri ja saanto olivat alhaiset, on tärkeää estää tarpeettomien sivutuotteiden muodostuminen. LdhA: n tyrmääminen tukahdutti laktaatin tuotannon kokonaan, mutta pta: n poistaminen ei johtanut asetaatin tuotannon merkittävään vähenemiseen. Samanlainen havainto tehtiin aerobisissa olosuhteissa (Vuoristo ym. 2015) ja vahvistaa asetaatin tuotannon vaihtoehtoisten väylien olemassaolon.
cadA: n ilmentyminen E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA: ssa riitti jo herättämään itakonaatin tuotannon, mutta kantaan kerääntyi myös pyruvaattia ja sitraattia, mikä osoittaa, että reitti itakonaattiin oli estynyt. Pyruvaatin kertyminen johtuu todennäköisesti redox-epätasapainosta. Redox-tasapainon säilyttämiseksi E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA: n on tuotettava itakonaattia yhdessä etanolin ja/tai sukkinaatin kanssa. Kun vuo itakonaattiin on liian pieni verrattuna etanoliin ja sukkinaattiin, kannoista tulee NADH-rajoittuneita, mikä johti pyruvaatin kertymiseen. Glta: n ja acnA: n lisäilmaantuminen C. glutamicumista kiihdytti voimakkaasti itakonaatin tuotantoa ja vähensi muodostuneen pyruvaatin määrää, jolloin itakonaattititteri kasvoi 8-kertaiseksi.
osoitimme aiemmin, että cadan heterologinen ilmentyminen johtaa inkluusiorungon muodostumiseen (Vuoristo et al. 2015). Strategiat cada: n liukoisuuden lisäämiseksi E: ssä. coli kuten laboratorio-suunnattu proteiinin evoluutio (Yuan et al. 2005) tai kodonin yhdenmukaistaminen (Angov et al. 2008) todennäköisesti lisää akonitaatin vuotoa. Toinen vaihtoehto on, että itakonaatin solunsisäisestä pitoisuudesta ja kuljetuskapasiteetin puutteesta voisi tulla nopeusrajoitus, jota myös Okamoto ym.ehdottivat. (2014). Dauaa luonnehdittiin E. colin pääsukkinaattikuljettajaksi,mutta sen osoitettiin kuljettavan myös muita dikarboksyylihappoja pH 7: ssä (Karinou et al. 2013), mikä viittaa siihen, että dauan yliekspressio voi lisätä itakonaatin vientiä. Useita oletettuja itakonaattikuljetusproteiineja on viime aikoina luonnehdittu Aspergillus-lajeilla (Li et al. 2011; van der Straat et al. 2014), mutta niiden toimivuutta E. coli-bakteerissa ei ole testattu.
yllättäen glutamaattia tuotettiin E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA-viljelmissä, joissa esiintyi C. glutamicumin gltA-ja acnA-yhdisteitä. Glutamaatin määrittämiseen käytetty UPLC-menetelmä paljasti myös, että kaikissa E. coli–kannoissa tuotettiin merkittäviä määriä alaniinia (1,5-3% C-mol). Alaniini on ilmeisesti tämän E. coli-kannan tavallinen käymistuote. Kirjallisuushaussa ei paljastunut muita tutkimuksia, joissa alaniinia olisi löydetty E. colin tavallisena käymistuotteena.
sekä itakonaatti että glutamaattisynteesi kilpailevat samoista välituotteista. Vuon lisäämiseksi itakonaattiin on siis tarpeen tukahduttaa glutamaatin tuotanto. E. colin glutamaatti-auksotrofit on toteutettu tyrmäämällä joko sitraattisyntaasia (gltA) koodaavat geenit (Mainguet et al. 2013), akonitaasi (acnA) (Gruer et al. 1997) tai isositraattidehydrogenaasi (icd) (Lakshmi and Helling 1976). GltA ja acnA osallistuvat itakonaatin tuotantoon, joten ne eivät sovellu ehdokkaiksi. Sekä icd: n että acnA: n knockoutien tiedetään olevan epävakaita aerobisissa olosuhteissa, koska ne johtavat gltA: n inaktivoitumiseen, mahdollisesti solunsisäisesti kertyvän sitraatin myrkyllisen vaikutuksen vuoksi (Gruer et al. 1997). Silti, Gruer ym. (1997) osoitti, että acnA knockouts olivat stabiileja anaerobisissa olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että vähemmän sitraattia kertyy anaerobisissa olosuhteissa, mahdollisesti NADH: n glta: n aktiivisuuden sääntelyn vuoksi. C: n NADH-epäherkän sitraattisyntaasin käyttöönotto. glutamicum in E. coli bw25113 (DE3) ∆PTA∆ldhA∆icd-bakteeria ei sen vuoksi välttämättä ole mahdollista käyttää. Yritykset ilmaista PKV-CGA: n geenejä kannassa epäonnistuivatkin. Jopa ilmentyminen pKV-C, joka sisältää vain cadA, johti menetys osa cada kasvun aikana, mikä viittaa siihen, että epävakaus icd knockouts voi johtua myös kertyminen suuria solunsisäisiä itakonaattipitoisuuksia.
tuoreessa tutkimuksessa (Okamoto et al. 2014), CadA onnistuneesti ilmaistiin ∆icd-kannassa, kun sitä viljeltiin lb-alustalla aerobisissa olosuhteissa. Akonitaasin (acnB) yliekspressio yhdessä cadan kanssa ∆icd-kannassa johti itakonaatin tuotannon lisääntymiseen (4,34 g/L). Kuitenkin, monimutkainen kasvualustan kuten lb, joka näytti vakauttaa ilmaisun cada ∆icd taustalla, ei suosita irtotavarana kemiantuotantoon, koska sen Korkea Hinta. Lisäksi ∆icd-kantaan kertyi huomattava määrä asetaattia ilman deleetiota asetaatin metaboliaan osallistuvissa metaboliareiteissä, kuten pta: ssa, ja tekijät suosittelivat asetaatin muodostamisreittien inaktivointia. Toisessa tutkimuksessa, Icd aktiivisuus C. glutamicumia madallettiin vaihtamalla ATG – aloituskodoni GTG: ksi tai TTG: ksi, mikä yhdessä heterologisen CadA-lausekkeen kanssa johti 60 mM: n itakonaattiin (Otten et al. 2015).
koska glutamaatin tuotanto riippuu typen saatavuudesta väliaineessa, testattiin vaihtoehtoista strategiaa glutamaatin tuotannon vähentämiseksi viljelemällä soluja typpipitoisessa väliaineessa. Tämä lisäsi itakonaatin tuotantoa jopa 5,4% Cmol: iin E. coli BW25113 (DE3) ΔptaΔldhA pKV-CGA: lla. Vuon lisääminen akonitaatista itakonaattiin todennäköisesti vähentäisi glutamaatin tuotannon määrää entisestään.
Escherichia coli-bakteerilla on useita mielenkiintoisia ominaisuuksia itakonaatin anaerobisessa tuotannossa: se on yksi harvoista teollisista mikro-organismeista, joka pystyy kasvamaan anaerobisissa olosuhteissa. Asetyyli-CoA-itakonaatin esiaste—on keskeinen metaboliitti E. colin dissimilaatioprosesseissa, mitä ei ole eukaryooteilla kuten Saccharomyces cerevisiae-vaikka useat ryhmät yrittävät muuttaa tätä (Kozak et al. 2014; Lian et al. 2014). E. coli muuntaa pyruvaatin asetyyli-CoA: ksi ja formiaatiksi pyruvaattiformiaattilyaasin avulla anaerobisissa olosuhteissa. Formiaatti voidaan myöhemmin jakaa arvokkaisiin H2: een ja CO2: een. Muut anaerobisissa olosuhteissa kasvavat teollisuuskannat, kuten S. cerevisiae ja maitohappobakteerit, käyttävät nad-riippuvaista pyruvaattidehydrogenaasia syntetisoidakseen asetyyli-CoA: ta, joka tuottaa ylimääräistä NADH: ta ja vaatii siten ylimääräistä kofaktorin regeneraatiota substraatin kustannuksella.
orgaanisten happojen mikrobituotantoa tutkivat monet ryhmät . Emäksen (kalkin) lisääminen on välttämätöntä, kun orgaanisia happoja tuotetaan neutraalissa pH: ssa. jatkojalostuksen aikana orgaanisen hapon suola on muunnettava orgaaniseksi hapoksi, mikä tapahtuu yleensä lisäämällä rikkihappoa. Näin syntyy valtavia määriä suoloja (kipsiä). Vaihtoehtoinen lähestymistapa on tuottaa orgaanista happoa alhaisessa pH: ssa. E. coli ei pysty kasvamaan alhaisilla pH-arvoilla ja orgaanisen hapon tuotanto E. coli-bakteerin kanssa voidaan näin ollen tehdä vain neutraaleilla pH-arvoilla.
tämä tutkimus osoittaa, että itakonaattia on mahdollista syntetisoida anaerobisesti käyttämällä E. colin sekahapporeittiä, jossa etanolin/H2: n ja sukkinaatin synteesi regeneroi NAD: n. Etanoli / H2 näyttää olevan paras yhdistelmä teollisuuskäyttöön, koska nämä tuotteet voidaan yksinkertaisesti erottaa toisistaan kiehumislämpötilansa perusteella ja markkinoida helposti irtokemikaaleina. Itakonaattia ja sukkinaattia on vaikeampi erottaa toisistaan, koska ne ovat molemmat dikarboksyylihappoja, joilla on C4-selkäranka. Lisäksi ne voivat kopolymeroitua, mikä vaikuttaa polymeerin ominaisuuksiin. Fumaraattireduktaasin (frd) poistaminen on yksi ilmeisistä ratkaisuista sukkinaatin muodostumisen estämiseksi (Zhou et al. 2006).
tämä on ensimmäinen kerta, kun raportoitiin E. coli-bakteerin anaerobista itakonaatin tuotantoa glukoosista. Havaitut sadot ja tuottavuus ovat vielä vaatimattomia. Keskeisten sivutuotteiden, kuten glutamaatin, sukkinaatin ja asetaatin, tuotantoreittien poistaminen ja pyruvaatin ja itakonaatin välisen reitin parantaminen on siksi ratkaisevan tärkeää, jotta saadaan aikaan itakonihapon kustannuskilpailukykyinen anaerobinen tuotantoprosessi.