a muramidáz hatása vegyes baktériumközösségre

absztrakt

baktériumközösségekben egy baktérium befolyásolhatja a populáció többi tagjának növekedését. Ezek a kölcsönhatások táplálkozási tényezőkön alapulhatnak, vagy a táptalajban felszabaduló bakteriális jelátviteli molekulákon keresztül fordulhatnak elő. Bemutatunk egy példát, amely megmutatja, hogy a fenti interakciós eszközök mellett a muramidázok, az enzimek, amelyek specifikusan hasítják a peptidoglikán láncokat, közvetíthetik a baktériumok közötti kölcsönhatásokat is. Fluoreszcens in situ hibridizáció alkalmazásával bemutatjuk, hogy a Lactococcus lactis muramidase AcmA képes hidrolizálni a Streptococcus thermophilus sejtfalát, anélkül, hogy befolyásolná az életképességet. A laktokokkusz muramidáz ezen intercelluláris aktivitása in vivo a streptococcusok lánczavarát eredményezi. Adataink arra engednek következtetni, hogy a láncok növekedési előnyöket adhatnak a streptococcusoknak aerob körülmények között.

1 Bevezetés

általánosan elfogadott, hogy a komplex baktériumközösségekben élő baktérium befolyásolhatja szomszédainak növekedését. A baktériumok közötti kölcsönhatások táplálkozási alapon valósíthatók meg . Az intercelluláris kommunikáció a jelátviteli molekulák különböző osztályainak közegébe történő felszabadulásával is megtörténik, ezáltal lehetővé téve a baktériumok számára a funkciók széles skálájának szabályozását, mint például az autoaggregáció, a kvórumérzékelés, a baktériumok differenciálódása és a konjugatív plazmidok átvitele. Jelzőmolekulákat azonosítottak mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív baktériumokban (áttekintéshez lásd ).

itt olyan eredményeket mutatunk be, amelyek azt mutatják, hogy a muramidáz, a baktérium enzim, amely specifikusan hasítja a peptidoglikánt, szintén közvetítheti a baktériumok közötti kölcsönhatásokat.

a baktériumok a következő négy típusú enzimet állíthatják elő, amelyek a sejtfal peptidoglikán hidrolizálására szolgálnak: muramidázok, amelyeket a lizozim-szerű enzimek példáznak, glükozaminidázok, amidázok és bizonyos peptidázok. A négy enzimtípus bármelyikének peptidoglikán-hidroláz aktivitása autolízist okozhat. A peptidoglikán hidrolázok olyan folyamatokban is részt vesznek, mint a peptidoglikán megvastagodása és forgalma, sejtosztódás, sejtkompetencia a DNS transzformációban, sporuláció és bakteriális motilitás .

Lactococcus lactis ssp. a jelentések szerint a plazmidokból és fágokból kikeményített mg1363 cremoris modelltörzs csak az acmA gén által kódolt muramidáz aktivitást tartalmazta. Ez a muramidáz felelős a Lactococcusok autolíziséért . Az érett AcmA fehérje jelen van mind a táptalajban, mind a C-terminális ismétléseken keresztül a sejtfelszínhez kapcsolódik . Az acmA gént klónozták és szekvenálták, majd létrehoztak egy deléciós mutánst, az Mg1363acma Xhamster1-et; a mutáns hosszú láncokat képez, így megmutatva a muramidáz részvételét a Lactococcus sejtek elválasztásában . Az acmA mutáns láncai megszakadhatnak az mg1363 vad típusú kiégett táptalaj hozzáadásával .

ebben a munkában megvizsgáltuk az L. lactis AcmA muramidázának a streptococcusokra gyakorolt hatását vegyes baktériumpopulációban.

2 Anyagok és módszerek

2,1 baktériumtörzs

2.2 növekedési feltételek

kísérleteket végeztünk M17glu táptalajban (M17 húsleves, 0,5% glükózzal kiegészítve ). A növekedési hőmérséklet a Lactococcusok esetében 30, a streptococcusok és a lactobacillusok esetében 42 C volt. A baktériumláncokat 0,01 mg ml−1 lizozim (Boehringer, Heilderberg, Németország) hozzáadásával megszakították a táptalajhoz, hacsak másként nem jelezzük. Az anaerob körülményeket genbox Anaer tasakokkal ellátott üvegekben hozták létre (Biom Enterprises SA, Marcy l ‘ Etoile, Franciaország). A folyékony közegben lemezeken termesztett tenyészeteket rázógépen (Apelex, Massy, Franciaország, 25 perc−1 hinta) tartottuk fenn a levegőztetés biztosítása és a baktériumok ülepedésének megakadályozása érdekében.

ülepedési vizsgálatokhoz a baktériumokat 1,5 ml-es műanyag spektrofotométeres küvettákban tenyésztették (Brand, Wertheim, Németország). A Lactococcusok megfelelő hígításait folyékony vagy olvasztott félfolyékony közegben oltottuk be (M17glu 0,0035% agarral, Difco, Detroit, USA). Az éjszakai növekedés után a küvetták fényképeit Sensia 400 film (Fuji, Tokió, Japán) segítségével készítették.

2.3 fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH), mikroszkópia és képelemzés

a Fish technikával speciálisan színezett Sejtkeverékek , a lactococcusokra (Lac, fluoreszceinnel jelölt, zöld) és a streptococcusokra (STR, rodaminnal jelölt, piros; P. Tailliez, nem publikált) specifikus próbákkal. A hibridizációt követően a képeket epifluoreszcens mikroszkóppal (Nikon, Tokió, Japán) és Visiolab 1000 képelemző rendszerrel (Biocom, Les Ulis, Franciaország) készítették, és az Adobe Illustrator 7.0 programmal (Edinburgh, Skócia) dolgozták fel.

a baktériumok lánchosszának becsléséhez a sejteket 2,5 KB ml−1 DAPI-val (4,6-diamino-2-fenilindol, Sigma, St. Louis, USA) színeztük, a képeket Visiolab 1000-rel készítettük, és a lánchosszt manuálisan számoltuk.

3 eredmények

3.1 A streptococcus láncok megszakítása a Lactococcus muramidáz AcmA által

úgy gondoltuk, hogy az ugyanazon faj sejtjeinek befolyásolása mellett az MG1363 muramidáz más fajok láncképződését is befolyásolhatja vegyes populációban. Ennek teszteléséhez mg1363 Lactococcus törzseket és acmA származékát, valamint egy láncképző S. thermophilus CNRZ7 törzset használtunk. A streptococcusok egyik napról a másikra történő tenyésztését exponenciális fázisban laktokokkusz tenyészettel kevertük. 3 órás inkubálás után 30 6CC-on a sejtkeverékeket rögzítettük és speciálisan színeztük a FISH technikával.

a streptococcusok és az MG1363 keverékében 3 óra inkubáció után nem maradnak streptococcus láncok. Ezzel szemben a CNRZ7 és az Mg1363acma 61 keverékében mindkét törzs láncai láthatók (ábra. 1). Mivel az Mg1363acma 61 és MG1363 izogén, és csak az AcmA jelenlétében különböznek egymástól, arra a következtetésre jutottunk, hogy az AcmA muramidáz felelős a streptococcus láncok megszakadásáért. Egy másik Lactococcus alfaj, az L. lactis ssp törzse. a lactis IL1403 hasonló kísérletekben képes volt megszakítani a streptococcus láncokat is. Ezekben a vegyes kultúrákban a laktokokkusz muramidáz két faj, mindegyik különböző nemzetség közötti kölcsönhatások közvetítőjeként működik, így az egyik faj muramidáza befolyásolhatja egy másik faj láncképző képességét.

megkérdeztük, hogy a Lactococcus muramidáz befolyásolja-e a streptococcusok életképességét ilyen körülmények között. Az exponenciális vagy stacionárius növekedési fázisban lévő CNRZ7 sejteket felfüggesztették az MG1363 és Mg1363acma Ca -1 tenyészet felülúszóiban. 4 órás inkubáció után nem figyeltek meg különbséget az életképességben, a borítás vagy az OD mérés alapján.

3.2 A baktériumláncok hatása az üledékképződésre

a láncként jelen lévő baktériumok gyorsabban üledékeznek, mint a szabad sejtek. Amikor láncképző streptococcusok (ábra. 2a), vagy L. lactis Mg1363acma 61 (ábra. 2c) egy éjszakán át folyékony közegben termesztik, üledéket képeznek a tartályban. Az MG1363 nem láncképző törzs nem ülepszik azonos körülmények között (ábra. 2e). A lizozim alacsony, nem baktericid koncentrációjának felhasználásával a CNRZ7 és az Mg1363acma 61 mutáns láncait egysejtűvé alakíthatjuk; ilyen körülmények között az ülepedésük csökken (ábra. 2b és d). A félfolyékony közegben az MG1363 és Mg1363acma MHz-es törzsek kolóniái különböztethetők meg. A vad típusú törzs csíkos telepeket képez (ábra. 2h), csakúgy, mint a lizozimmal termesztett Mg1363acma 61 törzs (ábra. 2g). Ezek a növekedési minták azt jelzik, hogy az elválasztott sejtek képesek, bár korlátozottak, üledék félig folyékony közegben. Ezzel szemben az Mg1363acma 61 kerek kolóniákat képez (ábra. 2f), ami azt jelezheti, hogy a hosszú láncok megakadályozzák az ülepedést ebben a közegben.

ezek a példák azt mutatják, hogy a baktériumok eloszlását folyékony és félfolyékony közegben befolyásolja a sejtek láncképző képessége.

3.3 növekedési előnyei S. thermophilus CNRZ7 a láncképző képesség miatt

az S. thermophilus CNRZ7 törzset használtuk annak tesztelésére, hogy a láncok kialakításának képessége hogyan befolyásolja a baktériumok növekedését. A streptococcusokat fakultatív anaeroboknak tekintik . Ezeknek a törzseknek az éjszakai tenyészeteit 1000-szer hígítottuk friss folyékony közegben, és a tenyészeteket két részre osztottuk. Lizozimot (0,01 mg ml−1) adtunk az egyik alikvothoz, majd minden tenyészetet tovább osztottunk hat csőbe és hat Petri-lemezbe (25 ml tartályonként). A mintákat egyik napról a másikra rázás nélkül inkubáltuk 42 C. Egy másik mintakészletet anaerob körülmények között inkubáltunk. Az összes minta OD600 értékét 10-szeres hígítás után mértük ugyanabban a közegben, amelyhez lizozimot (0,01 mg ml−1) adtunk a láncok megszakításához. Az eredmények azt mutatják (1. Táblázat), hogy a sejtek láncokban történő növekedése előnyt jelent a streptococcusok számára levegőztetett környezetben. Egy kivételével minden esetben a baktériumok hozama magasabb, ha a sejteket lemezeken termesztik, mint a csöveket. A folyékony közeget tartalmazó lemezek jobb növekedése azzal magyarázható, hogy a sejtek egyenletesebben oszlanak el a lemezeken a csövekhez képest, ami ezáltal lehetővé teszi a tápanyagokhoz való nagyobb hozzáférést. A kivétel a lemezeken aerob körülmények között lizozimmal termesztett streptococcusokra vonatkozik. Ebben az esetben a növekedés gátlását figyeltük meg az anaerob körülményekhez képest, anaerob:aerob OD600 Arány 1,4 volt. Amikor a sejteket csövekben tenyésztették, a levegőztetés hatása csökkent, és a növekedési arány 1,1 volt. Hasonló arányt kaptunk, amikor a sejteket lizozim nélküli táptalajban tenyésztettük (1.táblázat).

a streptococcus növekedésének gátlása aerob körülmények között lizozimmal magyarázható a láncok egyetlen sejtbe történő megszakításával, következésképpen lassabb ülepedéssel. Azt jelentették, hogy a növekedés az anaerobok folyékony közegben rázás nélkül gátolt körülbelül 0,5 cm-re a felszíntől, mert a penetráció az oxigén a közegben . Lizozim hiányában a CNRZ7 láncokat és üledékeket képez a tartály alján, az oxigénben gazdag zóna alatt; ebben az esetben az OD600 a lemezeken valamivel magasabb, mint a csövekben. Ezzel szemben, amikor a baktériumokat közegben lizozimmal tenyésztik, nem képeznek hosszú láncokat, amint azt mikroszkóppal és üledékkel lassabban igazolják; ebben az esetben több sejt marad az edény felső részén, azaz. a gátló zónában. Mivel a gátlási zóna felülete nagyobb a lemezeken, mint a csövekben, ebből következik, hogy a lemezeken történő növekedés jobban gátolt, mint a csövekben történő növekedés. A lemezek és csövek optikai sűrűségének értékei megerősítették ezt az érvelést (1.táblázat).

a streptococcusok gyenge aerob növekedésének alternatív magyarázata lizozim jelenlétében az lehet, hogy a sejtek aerob körülmények között érzékenyebbek a lizozimra, vagy lizozim jelenlétében érzékenyebbek az oxigénre. Ennek a kérdésnek a megválaszolására a CNRZ7-et egyik napról a másikra lemezeken termesztettük, mint az előző kísérletben, de különböző lizozim koncentrációkkal. Ezzel párhuzamosan egy sor lemezt tartottak fenn rázási körülmények között, hogy megakadályozzák az ülepedést és növeljék a levegőztetést. Ábrán bemutatott módon. 3, a rázással termesztett baktériumok hozama nem csökkent a lizozim koncentráció függvényében. Ez azt jelenti, hogy a streptococcusok nem válnak érzékenyebbé az oxigénre, amikor lizozimot adnak hozzá. Az aerob körülmények között termesztett CNRZ7 kultúrák alacsonyabb hozamát a magasabb oxigéngátlásnak tulajdonítjuk.

aerob körülmények között rázás nélkül megfigyeljük a hozam fokozatos csökkenését a lizozim koncentráció tartományában 2-től 10g ml-1-ig. Mint fentebb, ezt a bakteriális láncok ülepítésével magyarázzuk a lemezek alján lévő kevésbé oxigénezett zónába. A rázógépben nem figyeljük meg az OD csökkenését, mivel az ülepedés megakadályozható. Anaerob körülmények között az OD növekedése a lizozim koncentrációk azonos tartományában a csökkent ülepedéssel, majd a baktériumok egyenletesebb eloszlásával magyarázható a táptalajban. A mikroszkópos megfigyelések összhangban vannak ezzel az érveléssel, mivel a CNRZ7 láncok hossza meghaladja a 100 sejtet a lizozim nélküli közegben, és fokozatosan csökken 2−es átlagértékre, amikor a lizozim koncentrációját 10 6G ml-1-re növelték. A lánc hossza nagyjából azonos volt aerob és anaerob körülmények között.

a fenti eredmények arra engednek következtetni, hogy az anaerob baktériumok növekedési előnyei lehetnek, amelyek a láncok kialakításának képességétől függenek.

4 megbeszélés

kimutattuk, hogy a muramidáz közvetíti az L. lactis MG1363 és az S. thermophilus CNRZ7 közötti kölcsönhatásokat, és meg tudja határozni a ‘transz’lánc hosszát. Mennyire lehet általános ez a fajta viselkedés? A liofilizált Micrococcus lysodeikticus sejteket rutinszerűen használják az autolitikus aktivitás indikátoraként. Különböző laboratóriumok eredményei azt mutatják, hogy különböző baktériumfajok autolizinjei, pl. Az Enterococcus hirae, a Propionibacterium freudenreichii, a Lactobacillus acidophilus, a Lactobacillus fermentum, a L. helveticus vagy a Staphylococcus aureus elpusztíthatja a mikrokockák peptidoglikánját. Más bakteriális peptidoglikán-hidrolázok, például amidáz vagy glükozaminidáz, amelyek a Bacillus subtilis fő autolizinjei, elpusztíthatják a peptidoglikánt . Ezek az adatok arra utalnak, hogy az autolizineken keresztüli kölcsönhatások, amelyek láncszakadást eredményeznek, számos baktériumfaj között fennállhatnak.

a streptococcus láncok megfigyelt megszakadásának egyszerű magyarázata az, hogy a peptidoglikát közvetlenül hidrolizálja az L. lactis muramidáz, amelyet az MG1363 szabadít fel a táptalajba. Zimogramokat végeztünk az MG1363 felülúszókban jelenlévő hidrolitikus aktivitás mennyiségének becslésére. Mikrokális sejtek szubsztrátként történő felhasználásával megbecsültük az AcmA-aktivitás mennyiségét megközelítőleg megfelel a 0,1-nél megfigyeltnekg lizozim (az eredmények nem láthatók). Más tényezők, mint például a proteinázok, szintén szerepet játszhatnak ezekben a kölcsönhatásokban: kimutatták, hogy a klónozott sejtfalhoz horgonyzott proteináz gén bevezetése az Mg1363acma 61 mutánsba a lánc méretének csökkenését eredményezi . Beszámoltak arról , hogy a Lactococcus HtrA proteáz szerepet játszik az AcmA muramidáz lebontásában, ami szintén befolyásolhatja a lánchossz.

hatékony Streptococcus láncmegszakító aktivitást mutattunk filogenetikailag eltérő, de ennek ellenére szorosan rokon baktériumok L. lactis ssp. cremoris MG1363 és L. lactis ssp. lactis IL1403 . Érdekes módon, filogenetikailag távolabbi L. az autolizin-pozitívként leírt CNRZ10940 és CNRZ1102 helveticus törzsek a fent leírt körülmények között nem tudták megszakítani az Mg1363acma 61 vagy CNRZ7 láncokat. Ez a peptidoglikán összetételének különbségeivel és a filogenetikailag különböző baktériumok peptidoglikán hidrolázainak specifitásával magyarázható .

az itt leírt muramidázok szerepe fontos szerepet játszhat a kevert baktériumpopulációkban természetes körülmények között. Megmutattuk, hogy a baktériumok létezése az egysejtű állapotban a láncokkal szemben bizonyos esetekben következményekkel járhat a növekedésre. A láncok pusztulása és az ülepedési sebesség változása csak egy példa a peptidoglikán-hidrolázok intercelluláris hatásának lehetséges hatásaira. A bakteriális sejtfal részleges hidrolízise más hatásokkal is járhat. Például nemrégiben kimutatták, hogy az autolizinek befolyásolják a Staphylococcus epidermidis primer kötődését a szilárd felületekhez . Eredményeink alapján lehetséges, hogy az egyik faj muramidázai befolyásolhatják egy másik faj biofilmjeinek képződését egy vegyes közösségben.

Köszönetnyilvánítás

köszönjük A. Gruss a kézirat kritikai olvasatáért, G. Buist az Mg1363acma 61 törzs ajándékáért, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik a megbeszélések ösztönzéséért, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber a fotómunkában nyújtott segítségért és M. Cavaroc a technikai segítségért. Köszönjük P. Tailliez-nek a speciális fluoreszcens szondák ajándékát.