우리는 이전에 테레 우스에서 시스-아코 네이트 데카 르 복실 라제를 과발현하여 호기성 조건 하에서 이타코 네이트를 생성 할 수있는 대장균 균주를 구축했습니다. 이타코네이트로의 플럭스는 시트르산 신타제 및 아코니타제(아코니타제)를 코딩하는 유전자를 과발현시키고 포스포트란세틸라제 및 젖산 탈수소 효소를 코딩하는 유전자를 제거함으로써 강화되었다. 2015). 혐기성 조건 하에서 대장균은 아세테이트,숙신산,에탄올,포름 산염,젖산염,수소 및 이산화탄소와 같은 다양한 제품이 합성되는 혼합 산 발효를 사용합니다(클락 1989). 이러한 제품 및 대장균의 바이오 매스에 플럭스는 산화 환원 균형이 유지되는 방식으로 결합된다. 아세테이트 및 피루 베이트 생산뿐만 아니라 이타 코 네이트 생산은 숙신산 및/또는 에탄올의 공동 생산에 의해 균형을 이룰 수있는 보조 인자 감소를 초래합니다. 이 연구에서 우리는 대장균에서 이타 코 네이트의 혐기성 생산을 실현할 수 있는지 여부를 조사했습니다.
이타코네이트의 호기성 생산을 위해 이전에 개발된 대장균 균주는 혐기성 조건 하에서 재배되었다. 이타코네이트 생산을 시작하기에 충분하지 않았다. 대장균의 구연산 신타 제는 구연산 사이클을 통해 플럭스를 제어하고 있으며,이는 혐기성 조건 하에서 발생하는 높은 농도에 의해 알로 스테 론적으로 억제되기 때문에 이타 코 네이트의 생산을 방해했을 수 있습니다. 이러한 부정적인 피드백에 의해 영향을 받지 않는다. 1994). 그 결과 이타코네이트 생산에 긍정적인 영향을 주었지만,역가는 낮았다.
이타코네이트 역가 및 수율이 낮기 때문에 불필요한 부산물 형성을 방지하는 것이 중요하다. 락 테이트 생산을 완전히 억제하지만,학부모의 제거는 아세테이트 생산의 상당한 감소를 초래하지 않았다. 호기성 조건 하에서 유사한 관찰이 이루어졌다. 2015)및 아세테이트 생산을위한 대체 경로의 존재를 확인합니다.
대장균에서의 카다의 발현은 이미 이타코네이트 생산을 유발하기에 충분했지만,균주는 또한 피루브산 및 시트르산염을 축적하여 이타코네이트로의 경로가 억제되었음을 나타내었다. 피루브산 축적은 산화 환원 불균형으로 인해 발생할 수 있습니다. 산화 환원 균형을 유지하기 위해 대장균은 에탄올 및/또는 숙신산과 함께 이타 코 네이트를 생산해야합니다. 이타코네이트로의 플럭스가 에탄올과 숙시네이트로의 플럭스에 비해 너무 낮으면,균주는 피루브산 축적을 초래하는 나드-제한적이 될 것이다. 글루타미쿰으로부터 글루타미쿰 및 아크나의 추가적인 발현은 이타코네이트 생산을 강하게 자극하여 형성된 피루브산의 양을 감소시켜,이타코네이트의 역가를 8 배 증가시켰다.
우리는 이전에 카다의 이종 발현이 포함체 형성을 유도한다는 것을 보여 주었다(부 오리스토 외. 2015). 전략은 전자의 가다의 용해도를 증가. 이러한 실험실 지향 단백질 진화와 같은 대장균(위안 등. 2005)또는 코돈 조화(앙고프 외. 2008)는 아 코니 테이트에서 플럭스를 증가시킬 가능성이 있습니다. 또 다른 옵션은 이타코 네이트의 세포 내 농도와 수송 능력의 부족이 속도 제한이 될 수 있다는 것인데,이는 또한 오카모토 등에 의해 제안되었다. (2014). 다우아는 대장균의 주요 숙신산 수송체로 특징 지어졌지만,다른 디카르 복실 산도 또한 수송하는 것으로 나타났다. 2013),다우 아의 과발현이 이타 코 네이트 수출을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 몇몇 추정 이타코네이트 수송체들은 최근에 아스 페르 길 루스 종(리 외)에서 특징 지어졌다. 2011;반 데르 스트라트 외. 2014),그러나 대장균에 있는 그들의 기능은 시험되지 않았습니다.
예기치 않게,글루타민산염을 대장균에서 생산하였다. 글루타메이트를 결정하기 위해 사용 된 상향식 방법은 또한 모든 대장균 균주에서 상당한 양의 알라닌이 생성 된 것으로 나타났습니다(1.5–3%). 분명히,알라닌은이 대장균 균주의 표준 발효 산물입니다. 문헌 검색은 알라닌이 대장균의 표준 발효 산물로 발견 된 다른 연구를 밝히지 않았다.
이타코네이트와 글루타메이트 합성은 모두 동일한 중간체에 대해 경쟁한다. 이타 코 네이트로의 플럭스를 증가 시키려면 따라서 글루타메이트 생산을 억제 할 필요가있다. 대장균의 글루타메이트 보조영양체는 시트르산 신타제 중 하나를 암호화하는 유전자를 노크함으로써 실현되었다. 2013),아코니타제(아크나)(그루어 외). 1997)또는 이소 시트 레이트 탈수소 효소(락쉬미 및 헬링 1976). GltA 및 acnA 에 참여하고 있 itaconate 생산 및 그러므로 부적합한 후보자. 이 두 가지 모두 호기성 조건 하에서 불안정하다고 알려져 있는데,이는 세포내 시트르산(그루어 외)을 축적하는 독성 효과 때문일 수 있다. 1997). 아직도,그루어 등. (1997)는 아크나 녹아웃이 혐기성 조건 하에서 안정하다는 것을 보여 주었고,이는 아마도 혐기성 조건 하에서 구연산염이 덜 축적된다는 것을 암시한다. 이 약물은 구연산 신타 제를 함유하고 있습니다. glutamicum 에서 대장균 BW25113(DE3)∆pta∆ldhA∆icd 수 있습 따라서 가능하다. 실제로,변종에서 유전자 발현 시도 실패 했다. 2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일
최근 연구에서(오카모토 외. 2014),캐다 성공적으로 호기성 조건 하에서 파운드 배지에 배양 할 때 제 2 형질 전환증 균주에서 발현되었다. Overexpression aconitase(acnB)과 함께 cadA 에∆icd 변형 led 을 향상 itaconate 생산(4.34g/L). 그러나,파운드와 같은 복잡한 성장 매체는,그 높은 가격 때문에 대량 화학 생산을 위해 선호되지 않는다. 또한,상기 제 2 형질전달성 신진대사 균주는 아세트산 대사에 관여하는 대사 경로에서의 결실 없이 상당한 양의 아세테이트를 축적하였고,저자들은 아세테이트 형성 경로를 불활성화하도록 권고하였다. 또 다른 연구에서는, glutamicum 낮아졌으로 교환하기 ATG 시작 codon 을 GTG 나는 아시아 허브로 명성 높은 함께 분리 CadA 식 결과 60mM 의 itaconate(오튼 et al. 2015).
글루타메이트 생산 매체에 질소의 가용성에 따라 달라 집니다,글루타메이트 생산을 감소 하는 대체 전략 질소 제한 된 매체에 세포를 배양 하 여 테스트 했다. 이것은 이타코네이트의 생산을 최대 5.4%까지 향상시켰습니다. 아 코니 테이트에서 이타 코 네이트로의 플럭스를 강화하면 글루타메이트 생산의 양을 더 줄일 수 있습니다.
대장균은 이타코네이트의 혐기성 생산에 대한 몇 가지 흥미로운 특징을 가지고 있습니다:그것은 혐기성 조건에서 자랄 수있는 몇 안되는 산업 미생물 중 하나입니다. 아세틸-코아—이타코네이트의 전구체-는 대장균의 분해 과정에서 중심 대사 산물이며,이는 사카로 마이 세스 세레 비시 아와 같은 진핵 생물에서는 그렇지 않습니다. 2014;리안 외. 2014). E. 대장균은 혐기성 조건 하에서 피루브산-포름산 분해 효소에 의해 피루브산 아세틸-코아 및 포름산 염으로 전환한다. 포름 산염은 그 후 귀중한 수소와 이산화탄소로 나눌 수 있습니다. 세레비시아와 유산균과 같은 혐기성 조건에서 자랄 수 있는 다른 산업 균주는 아세틸코아를 합성하기 위해 나드 의존성 피루브산 탈수소 효소를 사용합니다.
유기산의 미생물 생산은 많은 그룹에 의해 연구된다. 하류 가공 도중 유기산 소금은 황산을 추가해서 보통 행해지는 유기산으로 개조되어야 합니다. 이로 인해 방대한 양의 소금(석고)이 생성됩니다. 대장균은 낮은 산도 값과 대장균과 유기 산 생산 따라서 중성 산도 값에서 수행 할 수 있습니다에서 성장 할 수 없습니다.
이 연구는 에탄올/수소와 숙신산의 합성이 나드를 재생하는 대장균의 혼합 산 경로를 사용하여 혐기성 이타 코 네이트를 합성 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 제품은 단순히 자신의 끓는 온도에 따라 분리,쉽게 벌크 화학 물질로 판매 할 수 있기 때문에 에탄올/수소는 산업 응용을위한 공동 제품의 최고의 세트가 될 것으로 보인다. 이타코네이트와 숙시네이트는 둘 다 씨 4 백본을 가진 디카르복실산이기 때문에 분리하기가 더 어렵다. 더욱 그들은 중합체 재산에 대한 충격이 있을 공중합할지도 모릅니다. 푸마 레이트 환원 효소를 삭제하는 것은 숙신산 형성을 방지하는 명백한 해결책 중 하나입니다(저우 외. 2006).
대장균에 대해 포도당으로부터 이타코네이트의 혐기성 생산이 보고된 것은 이번이 처음이다. 관찰 된 수확량과 생산량은 여전히 겸손합니다. 따라서 글루타메이트,숙신산 및 아세테이트와 같은 주요 부산물에 대한 경로를 제거하고 피루 베이트와 이타 코 네이트 사이의 경로를 향상시키는 것은 이타 콘산에 대한 비용 경쟁력있는 혐기성 생산 공정을 얻는 데 중요합니다.