Effekter av en muramidase på et blandet bakteriesamfunn

Abstrakt

i bakteriesamfunn kan en bakterie påvirke veksten av andre medlemmer av befolkningen. Disse interaksjonene kan være basert på næringsfaktorer eller kan forekomme via bakterielle signalmolekyler som frigjøres i mediet. Vi presenterer et eksempel som viser at i tillegg til de ovennevnte interaksjonsmidlene, kan muramidaser, enzymer som spesifikt spalter peptidoglykankjeder, også formidle interaksjoner mellom bakterier. Ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering viser vi At Lactococcus lactis muramidase AcmA kan hydrolysere celleveggen Av Streptococcus thermophilus, uten å påvirke levedyktigheten. Denne intercellulære aktiviteten til laktokokk muramidasen resulterer i kjedeforstyrrelser av streptokokker in vivo. Våre data fører oss til å foreslå at kjeder kan gi vekstfordeler til streptokokker i aerobe forhold.

1 Innledning

det er generelt akseptert at en bakterie som lever i komplekse bakterielle samfunn kan påvirke veksten av naboene. Interaksjoner mellom bakterier kan realiseres på næringsbasis . Intercellulær kommunikasjon skjer også ved frigjøring i mediet av forskjellige klasser av signalmolekyler, slik at bakterier kan regulere et bredt spekter av funksjoner, for eksempel autoaggregasjon, quorum-sensing, bakteriell differensiering og overføring av konjugative plasmider. Signalmolekyler er identifisert i Både Gram-positive og Gram-negative bakterier (for gjennomgang, se).

her presenterer vi resultater som viser at muramidase, det bakterielle enzymet som spesifikt spalter peptidoglykan, også kan formidle interaksjoner mellom bakterier.

Bakterier kan produsere følgende fire typer enzymer som hydrolyserer celleveggspeptidoglykan: muramidaser, som eksemplifiseres av lysozymlignende enzymer, glukosaminidaser, amidaser og visse peptidaser. Peptidoglykanhydrolaseaktiviteten til noen av disse fire typer enzymer kan forårsake autolyse. Peptidoglykanhydrolaser er også involvert i prosesser som peptidoglykan fortykkelse og omsetning, celledeling, cellekompetanse FOR DNA-transformasjon, sporulering og bakteriell motilitet .

lactococcus lactis ssp. cremoris modellstamme MG1363, herdet av plasmider og fager, ble rapportert å bare inneholde muramidaseaktivitet kodet av genet acmA. Denne muramidasen er ansvarlig for autolyse av laktokokker . Modent AcmA-protein er tilstede både i mediet og festet til celleoverflaten via Sine C-terminale gjentakelser . AcmA-genet ble klonet og sekvensert, og en delesjonsmutant, MG1363acmAΔ1, ble konstruert; mutanten danner lange kjeder, og viser dermed involvering av muramidase i laktokokkcelleseparasjon . Kjeder av acmA mutant kan forstyrres ved tilsetning av brukt kulturmedium av villtype MG1363 .

i dette arbeidet undersøkte vi evnen Til AcmA muramidase Av L. lactis å virke på streptokokker i en blandet bakteriepopulasjon.

2 Materialer og metoder

2.1 Bakteriestammer

2.2 Vekstforhold

Eksperimenter ble utført I m17glu medium (m17 buljong, supplert med 0,5% glukose). Veksttemperaturen var 30°C For laktokokker og 42°C for streptokokker og laktobaciller. Bakteriekjeder ble forstyrret ved å tilsette 0,01 mg ml−1 lysozym (Boehringer, Heilderberg, Tyskland) til mediet, med mindre annet er angitt. Anaerobe tilstander ble opprettet i krukker Med Genbox Anaer-doseposer ([email protected] SA, Marcy l ‘ Etoile, Frankrike). Kulturer dyrket i flytende medium i plater ble opprettholdt på en shaker (Apelex, Massy, Frankrike, 25 svinger min-1) for å gi lufting og for å forhindre bakteriell sedimentering.

for sedimenteringsstudier ble bakterier dyrket i plast 1,5 ml spektrofotometer kyvetter (Brand, Wertheim, Tyskland). Passende fortynninger av laktokokker ble inokulert i flytende eller smeltet halvflytende medium (M17glu med 0,0035% agar, Difco, Detroit, USA). Etter nattens vekst ble fotografier av kyvetter tatt med Sensia 400-film (Fuji, Tokyo, Japan).

2.3 Fluorescerende in situ hybridisering (FISK), mikroskopi og bildeanalyse

Celleblandinger spesielt farget VED HJELP AV FISKETEKNIKKEN, med prober spesifikke for laktokokker (LAC, merket med fluorescein, grønn) og for streptokokker (STR, merket med rhodamin, rød; P. Tailliez, upublisert). Etter hybridisering ble bildene tatt med et epifluorescensmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) Og Visiolab 1000 bildeanalysesystem (Biocom, Les Ulis, Frankrike) og behandlet Med Adobe Illustrator 7.0-programmet (Edinburgh, Skottland).

for å estimere bakteriell kjedelengde ble cellene farget med 2,5 µ ml-1 AV DAPI (4,6-diamino-2-fenylindol, Sigma, St. Louis, USA), bilder ble tatt Med Visiolab 1000 og kjedelengde ble telt manuelt.

3 Resultater

3.1 Forstyrrelse av streptokokkkjeder Ved laktokokk muramidase AcmA

vi vurderte at I tillegg til å påvirke celler av samme art, KAN mg1363 muramidase også påvirke kjededannelse av andre arter i blandet populasjon. For å teste dette brukte vi laktokokstammer MG1363 og dets acmA-derivat, samt en kjedeformende s. thermophilus-stamme CNRZ7. Vi blandet en overnatting kultur av streptokokker med en laktokokk kultur i eksponentiell fase. Etter en 3-h inkubasjon ved 30°C ble celleblandinger festet og spesielt farget ved HJELP AV FISKETEKNIKKEN.

i blandingen av streptokokker MED MG1363 er det ingen streptokokkkjeder igjen etter 3 h inkubasjon. I kontrast, i blandingen AV CNRZ7 og Mg1363acmaδ 1, er kjeder av begge stammer synlige (Fig . 1). Siden Mg1363acmaδ 1 OG MG1363 er isogene og bare skiller seg i Nærvær Av AcmA, konkluderer Vi med At AcmA muramidase er ansvarlig for forstyrrelse av streptokokkkjeder. Stammen fra en annen laktokokk underart, L. lactis ssp. lactis IL1403, var også i stand til å forstyrre streptokokkkjeder i lignende eksperimenter. I disse blandede kulturer fungerer laktokokk muramidasen som en mediator for samspill mellom to arter, hver av et annet slekt, slik at muramidasen av en art kan påvirke kjedeformende evne til en annen art.

vi spurte om laktokok muramidase påvirker levedyktigheten av streptokokker under disse forholdene. CNRZ7-celler i eksponentielle eller stasjonære vekstfaser ble suspendert i kultur-supernatanter AV MG1363 og MG1363acmAΔ1. Ingen forskjeller i levedyktighet ble observert etter 4 h inkubasjon, som bedømt ved plating eller od måling.

3.2 påvirkning av bakteriekjeder på sedimentering

Bakterier til stede som kjeder sediment raskere enn frie celler. Når kjedeformende streptokokker(Fig. 2a), Eller L. lactis Mg1363acmaδ 1 (Fig. 2c) dyrkes over natten i flytende medium, de danner et sediment i beholderen. Den ikke-kjedeformende stammen MG1363 sedimenterer ikke under de samme forholdene(Fig. 2e). Ved hjelp av lave ikke-bakteriedrepende konsentrasjoner av lysozym kan vi konvertere KJEDER AV CNRZ7 og Av mg1363acma Hryvnias Mutant til enkeltcelletilstanden; under disse forholdene reduseres deres sedimentering (Fig . 2b og d). I halvflytende medium kan kolonier AV stammer MG1363 og Mg1363acmaδ Skilles. Villtype-stammen danner stripete kolonier (Fig. 2h), som Gjør mg1363acmaδ stammen vokst med lysozym (Fig. 2g). Disse vekstmønstrene indikerer at separerte celler har kapasitet, men begrenset, til sediment i halvflytende medium. I kontrast danner Mg1363acmaδ 1 runde kolonier(Fig. 2f), noe som kan tyde på at de lange kjedene hindrer sedimentering i dette mediet.

disse eksemplene viser at fordelingen av bakterier i flytende og halvflytende medium påvirkes av cellenes evne til å danne kjeder.

3.3 Vekstfordeler Av S. thermophilus CNRZ7 på grunn av kjedeformende evne

brukte Vi s. thermophilus stamme CNRZ7 for å teste hvordan evnen til å danne kjeder påvirker veksten av bakterier. Streptokokker anses å være fakultative anaerober . Over natten kulturer av disse stammene ble fortynnet 1000 ganger i friskt flytende medium, og kulturer ble delt i to. Lysozym (0,01 mg ml-1) ble tilsatt til en av alikvotene, og hver kultur ble deretter videre fordelt i seks rør og seks Petri plater (25 ml per beholder). Prøvene ble inkubert uten risting over natten ved 42°C. Et annet sett med prøver ble inkubert under anaerobe forhold. OD600 av alle prøver ble målt etter 10 ganger fortynning i samme medium som lysozym (0,01 mg ml-1) ble tilsatt for å forstyrre kjeder. Resultatene indikerer (Tabell 1) at vekst av celler i kjeder gir en fordel for streptokokker i luftet miljø. I alle tilfeller, men en, er bakterieutbyttet høyere når celler dyrkes på plater sammenlignet med rør. Bedre vekst i plater som inneholder flytende medium kan forklares med en jevnere fordeling av celler på plater sammenlignet med rør, noe som dermed kan gi større tilgang til næringsstoffer. Unntaket gjelder streptokokker dyrket i plater under aerobic forhold med lysozym. I dette tilfellet observerte vi veksthemming sammenlignet med anaerobe forhold, med et anaerobt: aerob OD600-forhold på 1,4. Når celler ble dyrket i rør, ble effekten av lufting redusert, og vekstforholdet var 1,1. Et lignende forhold ble oppnådd når celler ble dyrket i medium uten lysozym (Tabell 1).

inhiberingen av streptokokkvekst under aerobe forhold med lysozym kan forklares ved forstyrrelse av kjeder i enkeltceller og følgelig langsommere sedimentering. Det ble rapportert at veksten av anaerober i flytende medium uten risting hemmes til ca 0,5 cm fra overflaten, på grunn av inntrengning av oksygen i mediet . I fravær av lysozym DANNER CNRZ7 kjeder og sedimenter til bunnen av beholderen, under den oksygenrike sonen; I DETTE tilfellet ER OD600 på plater litt høyere enn i rør. I kontrast, når bakterier dyrkes i medium med lysozym, danner de ikke lange kjeder, som verifisert ved mikroskopi og sediment langsommere; i dette tilfellet forblir flere celler i øvre del av karet, dvs. i den hemmende sonen. Da overflaten av inhiberingssonen er større på plater enn i rør, følger det at veksten på plater er mer hemmet enn veksten i rør. Verdiene av optisk tetthet i plater og rør bekreftet denne begrunnelsen (Tabell 1).

en alternativ forklaring på dårlig aerob vekst av streptokokker i nærvær av lysozym kan være at cellene er mer følsomme for lysozym i aerobe forhold eller mer følsomme for oksygen i nærvær av lysozym. FOR å løse dette spørsmålet ble CNRZ7 dyrket over natten i plater som i forrige eksperiment, men med forskjellige konsentrasjoner av lysozym. Parallelt ble et sett med plater opprettholdt under risteforhold for å forhindre sedimentering og for å øke luftingen. Som presentert I Fig. 3, utbyttet av bakterier dyrket med risting, ble ikke redusert som en funksjon av lysozymkonsentrasjon. Dette betyr at streptokokker ikke blir mer følsomme for oksygen når lysozym tilsettes. Vi tilskriver lavere utbytte AV CNRZ7 kulturer dyrket under aerobe forhold til høyere oksygeninhibering.

ved aerobe forhold uten risting observerer vi en gradvis reduksjon av utbyttet i lysozymkonsentrasjonen fra 2 til 10 µ ml-1. Som ovenfor forklarer vi dette ved sedimentering av bakteriekjeder til den mindre oksygenerte sonen på bunnen av platene. I shakeren observerer vi ikke denne reduksjonen i OD siden sedimentering er forhindret. Under anaerobe forhold kan økningen I OD i samme område av lysozymkonsentrasjoner forklares ved redusert sedimentering og påfølgende jevnere fordeling av bakterier i mediet. Mikroskopiske observasjoner er i samsvar med denne begrunnelsen, siden LENGDEN AV CNRZ7 kjeder er mer enn 100 celler i medium uten lysozym og gradvis avtar til en gjennomsnittlig verdi på 2 når lysozymkonsentrasjonen ble økt til 10 µ ml-1. Kjedelengder var omtrent det samme i aerobe og anaerobe forhold.

resultatene ovenfor fører oss til å foreslå at anaerobe bakterier kan ha vekstfordeler som avhenger av deres evne til å danne kjeder.

4 Diskusjon

vi har vist at muramidase medierer interaksjoner Mellom L. lactis MG1363 og s. thermophilus CNRZ7 og kan bestemme kjedelengden ‘i trans’. Hvor generell kan denne typen oppførsel være? Lyofiliserte Micrococcus lysodeikticus-celler brukes rutinemessig som en indikator på autolytisk aktivitet. Resultater fra ulike laboratorier viser at autolysiner av ulike bakteriearter, f. eks. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, lactobacillus fermentum, l. helveticus eller Staphylococcus aureus, kan ødelegge peptidoglykan av micrococci. Også andre bakterielle peptidoglykanhydrolaser, som amidase eller glukosaminidase, som er store autolysiner Av Bacillus subtilis, kan ødelegge peptidoglykan . Disse dataene tyder på at interaksjoner via autolysiner, som resulterer i kjedeforstyrrelser, kan eksistere mellom mange bakteriearter.

en enkel forklaring på den observerte forstyrrelsen av streptokokkkjeder er at peptidoglykan hydrolyseres direkte Av l. lactis muramidase som frigjøres AV MG1363 i mediet. Zymogrammer ble utført for å estimere mengden hydrolytisk aktivitet tilstede I mg1363 supernatanter. Ved bruk av mikrokokkale celler som substrat estimerte vi Mengden AcmA-aktivitet til å tilsvare omtrent det som ble observert for 0,1 µ lysozym (resultater ikke vist). Andre faktorer, som proteinaser, kan også spille en rolle i disse interaksjonene: det ble vist at innføring av klonet celleveggforankret proteinasegen i mg1363acmaδ 1 mutant resulterer i reduksjon av kjedestørrelse . Laktokokk htra protease ble rapportert å være involvert i nedbrytning Av AcmA muramidase, som også kan påvirke kjedelengden.

vi viste effektiv streptokokkkjedeforstyrrende aktivitet ved fylogenetisk forskjellige, men likevel nært beslektede bakterier L. lactis ssp. cremoris MG1363 og L. lactis ssp. lactis IL1403 . Interessant, fylogenetisk fjernere L. helveticus-stammene CNRZ10940 og CNRZ1102, beskrevet som autolysin-positive, kunne ikke forstyrre kjeder Av MG1363acmAΔ1 eller CNRZ7 under forhold beskrevet ovenfor. Dette kan forklares ved forskjeller i peptidoglykansammensetning og spesifisitet av peptidoglykanhydrolaser av fylogenetisk forskjellige bakterier .

rollen som muramidaser beskrevet her kan spille en viktig rolle i blandede bakteriepopulasjoner under naturlige forhold. Vi har vist at eksistensen av bakterier i enkeltcelletilstand versus kjeder i noen tilfeller kan få konsekvenser for vekst. Destruksjon av kjeder og endringer i sedimenteringshastigheten er bare ett eksempel på mulige effekter av den intercellulære virkningen av peptidoglykanhydrolaser. Delvis hydrolyse av bakteriell cellevegg kan også ha andre effekter. For eksempel ble det nylig vist at autolysiner påvirker primær vedlegg Av Staphylococcus epidermidis til faste overflater . I lys av våre resultater er det mulig at muramidaser av en art kan påvirke dannelsen av biofilmer av en annen art i et blandet samfunn.

Anerkjennelser

vi takker A. Gruss for kritisk lesing av manuskriptet, G. Buist for gaven Til mg1363acmaδ 1-stammen, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik for stimulerende diskusjoner, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber for hjelp i fotoarbeid og M. Cavaroc for teknisk hjelp. Vi takker P. Tailliez for gaven av spesifikke fluorescerende prober.