Vi har tidligere konstruert En e. coli-stamme Som er i stand til å produsere itakonat under aerobe forhold ved å overuttrykke cis-akonitatdekarboksylase (cadA) Fra A. terreus. Fluksen til itakonat ble forsterket ved å overuttrykke gener som koder for citratsyntase (gltA) og akonitase (acnA) fra c. glutamicum og eliminere gener som koder for fosfotransacetylase (pta) og laktatdehydrogenase (ldhA) (Vuoristo et al. 2015). Under anaerobe forhold bruker E. coli en blandet syrefermentering der ulike produkter som acetat, succinat, etanol, format, laktat, hydrogen og karbondioksid syntetiseres (Clark 1989). Fluxene til disse produktene og til biomasse i E. coli kombineres på en slik måte at en redoksbalanse opprettholdes. Itakonatproduksjon, samt acetat—og pyruvatproduksjon-resulterer i kofaktorreduksjon, som kan balanseres ved samproduksjon av succinat og / eller etanol. I denne studien undersøkte vi om det er mulig å realisere anaerob produksjon av itakonat I E. coli.
e. coli-stammene som tidligere ble utviklet for aerob produksjon av itakonat, ble dyrket under anaerobe forhold. Ekspresjon av cadA i E. coli BW25113 (DE3) var ikke tilstrekkelig til å initiere itakonatproduksjon. Citratsyntase fra E. coli styrer fluxen gjennom sitronsyresyklusen fordi den allosterisk hemmes av de høye NADH-konsentrasjonene som oppstår under anaerobe forhold, og dette kan ha forhindret produksjonen av itakonat. Citratsyntasen Fra c. glutamicum (GltA) påvirkes ikke av en slik negativ tilbakemelding (Eikmanns et al. 1994). Faktisk hadde co-ekspresjon av acnA og gltA Fra c. glutamicum i E. coli BW25113 (DE3) en positiv effekt på itakonatproduksjon da det resulterte i itakonatproduksjon, men titrene var lave.
da itakonattiter og utbytte var lave, er det viktig å forhindre unødvendig biproduktdannelse. Å slå ut ldhA fullstendig undertrykt laktatproduksjon, men eliminasjonen av pta resulterte ikke i en signifikant reduksjon av acetatproduksjonen. En lignende observasjon ble gjort under aerobic forhold (Vuoristo et al. 2015) og bekrefter eksistensen av alternative veier for acetatproduksjon.
Ekspresjon av cadA i E. coli BW25113 (DE3) Δδ var allerede tilstrekkelig til å fremkalle itakonatproduksjon, men stammen akkumulerte også pyruvat og citrat, noe som indikerer at banen til itakonat var begrenset. Pyruvatakkumulering skyldes sannsynligvis en redoksubalanse. For å opprettholde redoksbalanse må E. coli BW25113 (DE3) Δδ produsere itakonat sammen med etanol og / eller succinat. Når fluksen til itakonat er for lav sammenlignet med fluksene til etanol og succinat, vil stammene bli NADH-begrenset, noe som resulterte i pyruvatakkumulering. Ytterligere ekspresjon av gltA og acnA fra c. glutamicum stimulerte sterkt itakonatproduksjon og reduserte mengden pyruvat som ble dannet, noe som resulterte i en 8 ganger økt titer av itakonat.
vi har tidligere vist at heterologe uttrykk for cadA fører til inkludering kroppsdannelse (Vuoristo et al. 2015). Strategier for å øke oppløseligheten Av CadA I E. coli som laboratorierettet proteinutvikling (Yuan et al. 2005) eller kodon harmonisering (Angov Et al. 2008) er sannsynlig å øke fluxen fra akonitat. Et annet alternativ er at intracellulær konsentrasjon av itakonat og mangel på transportkapasitet kan bli hastighetsbegrensende, som også ble foreslått Av Okamoto et al. (2014). DauA ble karakterisert som den viktigste succinattransportøren I E. coli, men det ble vist å transportere også andre dikarboksylsyrer ved pH 7 (Karinou et al. 2013), noe som tyder på at overuttrykk av dauA kan øke itaconateksporten. Flere antatte itaconate transportører har nylig blitt karakterisert I Aspergillus arter (Li et al. 2011; van Der Straat et al. 2014), men deres funksjonalitet I E. coli har ikke blitt testet.
Uventet ble glutamat produsert I e. coli BW25113 (DE3) Δδ kulturer der gltA og acnA Av c. glutamicum ble uttrykt. UPLC-metoden som ble brukt til å bestemme glutamat viste også at betydelige mengder alanin ble produsert (1,5 – 3% C-mol) i Alle e. coli-stammer. Tilsynelatende er alanin et standard fermenteringsprodukt av Denne e. coli-stammen. Litteratursøk avslørte ikke andre studier der alanin ble funnet som et standard fermenteringsprodukt Av E. coli.
både itakonat-og glutamatsyntese konkurrerer om de samme mellomproduktene. For å øke fluxen til itakonat er det derfor nødvendig å undertrykke glutamatproduksjon. Glutamat auxotrophs Av E. coli har blitt realisert ved å slå ut gener som koder for enten citratsyntase (gltA) (Mainguet et al. 2013), aconitase (Acna) (Gruer et al. 1997) eller isocitrat dehydrogenase (icd) (Lakshmi og Helling 1976). GltA og acnA er involvert i itakonatproduksjon og er derfor uegnede kandidater. Både icd og acnA knockouts er kjent for å være ustabile under aerobe forhold, da de fører til inaktivering av gltA, muligens på grunn av en toksisk effekt av intracellulært akkumulerende citrat (Gruer et al. 1997). Fortsatt, Gruer et al. (1997) viste at acnA knockouts var stabile under anaerobe forhold, noe som tyder på at mindre citrat akkumuleres under anaerobe forhold, muligens på grunn av reguleringen Av GltA-aktiviteten VED NADH. Innføring AV NADH-ufølsom citratsyntase Av C. glutamicum I E. coli BW25113 (DE3) ∆pta∆ldhA∆icd er derfor ikke mulig. Faktisk var forsøk på å uttrykke gener av pKV-CGA i stammen mislykket. Selv ekspresjon av pKV-C, som bare inneholder cadA, resulterte i tap av en del av cadA under vekst, noe som tyder på at ustabiliteten til icd-knockouts også kan skyldes akkumulering av høye intracellulære itakonatkonsentrasjoner.
i en nylig studie (Okamoto et al. 2014), CadA ble vellykket uttrykt i ∆icd belastning når dyrket PÅ LB medium under aerobic forhold. Overekspresjon av akonitase (acnB) sammen med cadA i den ∆icd-stammen førte til økt produksjon av itakonater (4,34 g / L). Et komplekst vekstmedium som LB, som syntes å stabilisere uttrykket for cadA i ∆icd-bakgrunn, er imidlertid ikke foretrukket for bulkkjemisk produksjon på grunn av den høye prisen. I tillegg akkumulerte den ∆icd-stammen en betydelig mengde acetat uten sletting i metabolske veier involvert i acetatmetabolisme, slik som pta, og forfatterne anbefalte å inaktivere acetatdannende veier. I en annen studie, Icd aktivitet Av C. glutamicum ble senket ved å bytte ATG-startkodonet TIL GTG eller TTG, som sammen med et heterologt CadA-uttrykk resulterte i 60 mM itakonat (Otten et al. 2015).
da glutamatproduksjonen avhenger av tilgjengeligheten av nitrogen i mediet, ble en alternativ strategi for å redusere glutamatproduksjonen testet ved å dyrke celler i nitrogenbegrenset medium. Dette økte produksjonen av itakonat til opptil 5,4% Cmol med E. coli BW25113 (DE3) Hryvptaδ pKV-CGA. Forbedring av fluxen fra akonitat til itakonat vil trolig ytterligere redusere mengden glutamatproduksjon.
Escherichia coli har flere interessante egenskaper for anaerob produksjon av itakonat: Det er en av de få industrielle mikroorganismer som kan vokse under anaerobe forhold. Acetyl-CoA-en forløper for itakonat – er en sentral metabolitt i dissimileringsprosesser i E. coli, noe som ikke er tilfelle i eukaryoter som Saccharomyces cerevisiae—selv om flere grupper prøver å endre dette (Kozak et al. 2014; Lian et al. 2014). E. coli omdanner pyruvat til acetyl-CoA og formiat ved pyruvatformiat-lyase under anaerobe forhold. Formiatet kan deretter deles inn i verdifulle H2 OG CO2. Andre industrielle stammer som er i stand til å vokse under anaerobe forhold, som S. cerevisiae og melkesyrebakterier, bruker NAD-avhengig pyruvat dehydrogenase til å syntetisere acetyl-CoA, noe som genererer ekstra NADH og dermed krever ekstra kofaktorregenerering på bekostning av substrat.
den mikrobielle produksjonen av organiske syrer studeres av mange grupper . Tilsetning av base (kalk) er nødvendig når organiske syrer produseres ved nøytral pH. under nedstrøms behandling må det organiske syresaltet omdannes til organisk syre, som vanligvis gjøres ved å tilsette svovelsyre. Dette resulterer i produksjon av store mengder salter (gips). En alternativ tilnærming er å produsere den organiske syren ved lav pH. E. coli kan ikke vokse ved lave pH-verdier, og organisk syreproduksjon med E. coli kan derfor bare gjøres ved nøytrale pH-verdier.
denne studien viser at det er mulig å syntetisere itakonat anaerobt ved å bruke den blandede syreveien Til E. coli, hvor syntesen av etanol / H2 og succinat regenererer NAD. Etanol / H2 synes å være det beste settet av ko-produkter for industriell bruk, da disse produktene enkelt kan skilles ut basert på deres kokende temperaturer, og lett markedsføres som bulkkjemikalier. Itakonat og succinat er vanskeligere å skille fordi de er begge dikarboksylsyrer med En c4-ryggrad. Videre kan de kopolymerisere, noe som vil påvirke polymeregenskapene. Sletting av fumaratreduktase (frd) er en av de åpenbare løsningene for å forhindre succinatdannelse (Zhou et al. 2006).
dette er første gang anaerob produksjon av itakonat fra glukose ble rapportert For E. coli. De observerte utbyttene og produktivitetene er fortsatt beskjedne. Eliminering av veiene til store biprodukter som glutamat, succinat og acetat, og forbedring av banen mellom pyruvat og itakonat er derfor avgjørende for å oppnå en kostnadseffektiv anaerob produksjonsprosess for itakonsyre.