wpływ muramidazy na mieszaną społeczność bakteryjną

Streszczenie

w społecznościach bakteryjnych jedna bakteria może wpływać na wzrost innych członków populacji. Interakcje te mogą być oparte na czynnikach odżywczych lub mogą wystąpić za pośrednictwem cząsteczek sygnałowych bakterii, które są uwalniane w pożywce. Przedstawiamy przykład, pokazujący, że oprócz powyższych sposobów interakcji, muramidazy, enzymy, które specyficznie rozszczepiają łańcuchy peptydoglikanowe, mogą również pośredniczyć w interakcjach między bakteriami. Wykorzystując fluorescencyjną hybrydyzację in situ wykazujemy, że Lactococcus lactis muramidase AcmA może hydrolizować ścianę komórkową Streptococcus thermophilus, bez wpływu na żywotność. Ta międzykomórkowa aktywność muramidazy laktokokowej powoduje przerwanie łańcucha paciorkowców in vivo. Nasze dane sugerują, że łańcuchy mogą dawać korzyści wzrostowe paciorkowcom w warunkach tlenowych.

1 Wprowadzenie

ogólnie przyjmuje się, że bakteria żyjąca w złożonych społecznościach bakteryjnych może wpływać na wzrost swoich sąsiadów. Interakcje między bakteriami mogą być realizowane na zasadzie odżywczej . Komunikacja międzykomórkowa odbywa się również poprzez uwalnianie do środowiska różnych klas cząsteczek sygnalizacyjnych, co pozwala bakteriom regulować szeroki zakres funkcji, takich jak autoagregacja, wykrywanie kworum, różnicowanie bakterii i przenoszenie sprzężonych plazmidów. Cząsteczki sygnalizacyjne zostały zidentyfikowane zarówno w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych (do przeglądu, patrz ).

tutaj prezentujemy wyniki pokazujące, że muramidaza, bakteryjny enzym, który specyficznie rozszczepia peptydoglikan, może również pośredniczyć w interakcjach między bakteriami.

bakterie mogą wytwarzać następujące cztery rodzaje enzymów, które hydrolizują peptydoglikany ściany komórkowej: muramidazy, których przykładem są enzymy podobne do lizozymu, glukozaminidazy, amidazy i niektóre peptydazy. Aktywność hydrolazy peptydoglikanowej któregokolwiek z tych czterech rodzajów enzymów może powodować autolizę. Hydrolazy peptydoglikanowe są również zaangażowane w procesy takie jak zagęszczanie i obrót peptydoglikanów, podział komórek, kompetencje komórek do transformacji DNA, sporulacja i ruchliwość bakterii .

Lactococcus lactis ssp. szczep modelowy cremoris MG1363, utwardzony z plazmidów i fagów, wykazywał jedynie aktywność muramidazy kodowanej przez gen acmA. Muramidaza ta jest odpowiedzialna za autolizę laktokoków . Dojrzałe białko AcmA jest obecne zarówno w pożywce, jak i przyłączone do powierzchni komórki poprzez jej powtórzenia C-końcowe . Gen acmA został sklonowany i zsekwencjonowany, a mutant delecyjny, MG1363acmAΔ1, został skonstruowany; mutant tworzy długie łańcuchy, wykazując w ten sposób udział muramidazy W separacji komórek laktokokowych . Łańcuchy mutanta acmA mogą zostać zakłócone przez dodanie zużytego pożywki hodowlanej typu dzikiego MG1363 .

w tej pracy zbadaliśmy zdolność ACMA muramidazy L. lactis do działania na paciorkowce w mieszanej populacji bakterii.

2 Materiały i metody

2.1 szczepy bakterii

2.2 warunki wzrostu

eksperymentowano na pożywce M17glu (bulion M17, uzupełniony 0,5% glukozy). Temperatura wzrostu wynosiła 30°C dla laktokoków i 42°C dla paciorkowców i pałeczek kwasu mlekowego. Łańcuchy bakteryjne zostały przerwane przez dodanie 0,01 mg ml−1 lizozymu (Boehringer, Heilderberg, Niemcy) do pożywki, o ile nie wskazano inaczej. Warunki beztlenowe powstały w słoikach z saszetkami Genbox Anaer (Biomérieux SA, Marcy L ’ Etoile, Francja). Hodowle hodowane w ciekłym podłożu w płytkach utrzymywano na wytrząsarce (Apelex, Massy, Francja, 25 min-1), aby zapewnić napowietrzanie i zapobiec sedymentacji bakterii.

do badań sedymentacyjnych bakterie hodowano w plastikowych kuwetach spektrofotometrycznych o pojemności 1,5 ml (Brand, Wertheim, Niemcy). Odpowiednie rozcieńczenia laktokoków zaszczepiono w ciekłym lub stopionym medium półpłynnym (M17glu z 0,0035% agarem, Difco, Detroit, USA). Po nocnym wzroście zdjęcia kuwet zostały wykonane za pomocą filmu Sensia 400 (Fuji, Tokio, Japonia).

2.3 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), mikroskopia i analiza obrazu

mieszanki komórkowe specjalnie barwione przy użyciu techniki FISH , z sondami specyficznymi dla laktokoków (LAC, oznaczony fluoresceiną, zielony) i dla paciorkowców (STR, oznaczony rodaminą, czerwony; P. Tailliez, niepublikowany). Po hybrydyzacji obrazy były rejestrowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (Nikon, Tokio, Japonia) i systemu analizy obrazu Visiolab 1000 (Biocom, Les Ulis, Francja) i przetwarzane za pomocą programu Adobe Illustrator 7.0 (Edynburg, Szkocja).

aby oszacować długość łańcucha bakterii, komórki zabarwiono 2,5 µg ml−1 DAPI (4,6-diamino-2-fenylindol, Sigma, St.Louis, USA), obrazy zarejestrowano za pomocą Visiolab 1000 i długość łańcucha policzono ręcznie.

3 Wyniki

3.1 zaburzenie łańcuchów paciorkowców przez muramidazę laktokokową AcmA

uznaliśmy, że oprócz wpływu na komórki tego samego gatunku, muramidaza MG1363 może również wpływać na tworzenie łańcuchów innych gatunków w mieszanej populacji. Aby to przetestować, użyliśmy szczepów laktokoków MG1363 i jego pochodnej acmA,a także łańcuchotwórczego szczepu S. thermophilus CNRZ7. Mieszaliśmy nocną kulturę paciorkowców z kulturą laktokokową w fazie wykładniczej. Po 3-godzinnej inkubacji w temperaturze 30°C mieszaniny komórkowe utrwalano i specjalnie barwiono przy użyciu techniki rybnej.

w mieszaninie paciorkowców z MG1363 nie ma łańcuchów paciorkowców pozostających po 3 godzinach inkubacji. Natomiast w mieszaninie CNRZ7 i MG1363acmAΔ1 widoczne są łańcuchy obu szczepów (Fig. 1). Ponieważ MG1363acmAΔ1 i MG1363 są izogeniczne i różnią się tylko obecnością AcmA, wnioskujemy, że muramidaza AcmA jest odpowiedzialna za zakłócenie łańcuchów paciorkowców. Szczep z innego podgatunku Lactococcus, L. lactis ssp. lactis IL1403 był również w stanie zakłócić łańcuchy paciorkowców w podobnych eksperymentach. W tych mieszanych kulturach muramidaza laktokokowa działa jako mediator interakcji między dwoma gatunkami, każdy z innego rodzaju, tak że muramidaza jednego gatunku może wpływać na zdolność formowania łańcucha innego gatunku.

zapytaliśmy, czy muramidaza laktokokowa wpływa na żywotność paciorkowców w tych warunkach. Komórki CNRZ7 w wykładniczych lub stacjonarnych fazach wzrostu zawieszono w supernatantach kulturowych MG1363 i MG1363acmAΔ1. Nie zaobserwowano różnic w żywotności po 4 h inkubacji, ocenianej na podstawie poszycia lub pomiaru OD.

3.2 wpływ łańcuchów bakteryjnych na sedymentację

bakterie obecne w łańcuchach osadują szybciej niż wolne komórki. Podczas tworzenia łańcuchów paciorkowce (rys. 2a) lub L. lactis MG1363acmAΔ1 (rys. 2C) są uprawiane przez noc w ciekłym środowisku, tworzą osad w zbiorniku. Szczep MG1363 nie tworzący łańcuchów nie osadza się w tych samych warunkach (rys. 2e). Stosując niskie, Nie bakteriobójcze stężenia lizozymu, możemy przekształcić łańcuchy mutanta CNRZ7 i MG1363acmAΔ1 w stan jednokomórkowy; w tych warunkach ich sedymentacja jest zmniejszona (Fig. Odpowiednio 2b i d). W środowisku półpłynnym można wyróżnić kolonie szczepów MG1363 i MG1363acmAΔ1. Szczep typu dzikiego tworzy kolonie w postaci smug (rys. 2h), podobnie jak szczep MG1363acmAΔ1 wyhodowany z lizozymem (rys. 2g). Te wzorce wzrostu wskazują, że oddzielone komórki mają zdolność, choć ograniczoną, do osadu w środowisku półpłynnym. Natomiast MG1363acmAΔ1 tworzy okrągłe kolonie (rys. 2f), co może wskazywać, że długie łańcuchy zapobiegają sedymentacji w tym medium.

te przykłady pokazują, że rozmieszczenie bakterii w ciekłym i półpłynnym środowisku zależy od zdolności komórek do tworzenia łańcuchów.

3.3 zalety wzrostu S. thermophilus CNRZ7 ze względu na zdolność do formowania łańcuchów

użyliśmy szczepu S. thermophilus CNRZ7, aby sprawdzić, w jaki sposób zdolność do formowania łańcuchów wpływa na wzrost bakterii. Paciorkowce są uważane za fakultatywne beztlenowce . Przez Noc Kultury tych szczepów rozcieńczano 1000-krotnie w świeżej ciekłej pożywce, a Kultury dzielono na dwie części. Lizozym (0,01 mg ml-1) dodano do jednej z porcji, a następnie każdą hodowlę rozprowadzono dalej w sześciu probówkach i sześciu płytkach Petriego (25 ml na pojemnik). Próbki inkubowano bez wstrząsania przez noc w temperaturze 42°C. Kolejny zestaw próbek inkubowano w warunkach beztlenowych. OD600 wszystkich próbek mierzono po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu w tym samym podłożu, do którego dodano lizozym (0,01 mg ml−1) w celu przerwania łańcuchów. Wyniki wskazują (Tabela 1), że wzrost komórek w łańcuchach daje korzyść paciorkowcom w środowisku napowietrzonym. We wszystkich przypadkach oprócz jednego, wydajność bakterii jest wyższa, gdy komórki są hodowane na płytkach w porównaniu do rurek. Lepszy wzrost w płytkach zawierających płynne podłoże można wytłumaczyć bardziej równomiernym rozmieszczeniem komórek na płytkach w porównaniu do rurek, co mogłoby w ten sposób umożliwić większy dostęp do składników odżywczych. Wyjątek dotyczy paciorkowców hodowanych na płytkach w warunkach tlenowych z lizozymem. W tym przypadku zaobserwowaliśmy zahamowanie wzrostu w porównaniu do warunków beztlenowych, przy stosunku beztlenowo-tlenowym OD600 wynoszącym 1,4. Gdy komórki hodowano w probówkach, efekty napowietrzania były zmniejszone, a współczynnik wzrostu wynosił 1,1. Podobny stosunek uzyskano, gdy komórki hodowano w pożywce bez lizozymu(Tabela 1).

hamowanie wzrostu paciorkowców w warunkach tlenowych za pomocą lizozymu można wytłumaczyć rozpadem łańcuchów w pojedyncze komórki i w konsekwencji wolniejszą sedymentacją. Stwierdzono, że wzrost beztlenowców w ciekłym środowisku bez wstrząsania jest hamowany do około 0,5 cm od powierzchni, z powodu przenikania tlenu do medium . W przypadku braku lizozymu CNRZ7 tworzy łańcuchy i osady na dnie pojemnika, poniżej strefy bogatej w tlen; w tym przypadku OD600 na płytkach jest nieco wyższy niż w probówkach. Natomiast gdy bakterie są hodowane w pożywce z lizozymem, nie tworzą długich łańcuchów, co potwierdza mikroskopia i osad wolniej; w tym przypadku więcej komórek pozostaje w górnej części naczynia, tj. w strefie hamującej. Ponieważ powierzchnia strefy hamowania jest większa na płytkach niż w probówkach, wynika z tego, że wzrost na płytkach jest bardziej zahamowany niż wzrost w probówkach. Wartości gęstości optycznej w płytkach i tubach potwierdziły to rozumowanie (Tabela 1).

alternatywnym wyjaśnieniem słabego tlenowego wzrostu paciorkowców w obecności lizozymu może być to, że komórki są bardziej wrażliwe na lizozym w warunkach tlenowych lub bardziej wrażliwe na tlen w obecności lizozymu. Aby rozwiązać ten problem, CNRZ7 uprawiano przez noc w płytkach, tak jak w poprzednim eksperymencie, ale z różnymi stężeniami lizozymu. Równolegle utrzymywano zestaw płyt w Warunkach wytrząsania, aby zapobiec sedymentacji i zwiększyć napowietrzanie. Jak przedstawiono na Fig. 3, wydajność bakterii uprawianych z wytrząsaniem nie zmniejszyła się w funkcji stężenia lizozymu. Oznacza to, że paciorkowce nie stają się bardziej wrażliwe na tlen po dodaniu lizozymu. Niższe plony kultur CNRZ7 hodowanych w warunkach tlenowych przypisujemy wyższym hamowaniom tlenu.

w warunkach tlenowych bez wstrząsania obserwujemy stopniowy spadek wydajności w zakresie stężenia lizozymu od 2 do 10 µg ml−1. Jak wyżej, wyjaśniamy to poprzez sedymentację łańcuchów bakteryjnych do mniej utlenionej strefy na dnie płyt. W shakerze nie obserwujemy tego spadku OD, ponieważ zapobiega się sedymentacji. W warunkach beztlenowych wzrost OD w tym samym zakresie stężeń lizozymu można wyjaśnić zmniejszoną sedymentacją, a następnie bardziej równomierną dystrybucją bakterii w pożywce. Obserwacje mikroskopowe są zgodne z tym rozumowaniem, ponieważ długość łańcuchów CNRZ7 wynosi ponad 100 komórek w pożywce bez lizozymu i stopniowo zmniejsza się do średniej wartości 2, Gdy stężenie lizozymu zostało zwiększone do 10 µg ml-1. Długości łańcuchów były mniej więcej takie same w warunkach tlenowych i beztlenowych.

powyższe wyniki prowadzą nas do wniosku, że bakterie beztlenowe mogą mieć zalety wzrostu, które zależą od ich zdolności do tworzenia łańcuchów.

4 dyskusja

wykazaliśmy, że muramidaza pośredniczy w interakcjach między L. lactis MG1363 i S. thermophilus CNRZ7 i może określać Długość łańcucha „w trans”. Jak ogólne może być takie zachowanie? Liofilizowane komórki Micrococcus lysodeikticus są rutynowo stosowane jako wskaźnik aktywności autolitycznej. Wyniki różnych laboratoriów pokazują, że autolizyny różnych gatunków bakterii, np. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus lub Staphylococcus aureus mogą niszczyć peptydoglikan mikrokoków. Ponadto inne bakteryjne hydrolazy peptydoglikanowe, takie jak amidaza lub glukozaminidaza, które są głównymi autolizynami Bacillus subtilis, mogą niszczyć peptydoglikan . Dane te sugerują, że mogą istnieć interakcje za pośrednictwem autolizyn, które powodują zakłócenia łańcucha między wieloma gatunkami bakterii.

prostym wyjaśnieniem obserwowanego zakłócenia łańcuchów paciorkowców jest to, że peptydoglikan jest bezpośrednio hydrolizowany przez muramidazę L. lactis, która jest uwalniana przez MG1363 do pożywki. Wykonano zymogramy w celu oszacowania aktywności hydrolitycznej w supernatantach MG1363. Stosując komórki mikrokokalne jako substrat oszacowaliśmy, że aktywność AcmA odpowiada w przybliżeniu aktywności 0,1 µg lizozymu (wyniki nie zostały pokazane). Inne czynniki, takie jak proteinazy, mogą również odgrywać rolę w tych interakcjach: wykazano, że wprowadzenie klonowanego genu proteinazy zakotwiczonej w ścianie komórkowej w zmutowanym MG1363acmAΔ1 powoduje zmniejszenie rozmiaru łańcucha . Stwierdzono , że laktokokowa proteaza HtrA bierze udział w degradacji Muramidazy AcmA, co może również wpływać na długość łańcucha.

wykazaliśmy wydajną aktywność łańcuchów paciorkowców zakłócającą filogenetycznie różne, ale jednak blisko spokrewnione bakterie L. lactis ssp. cremoris MG1363 i L. lactis ssp. lactis IL1403 Co ciekawe, filogenetycznie bardziej odległe L. szczepy helveticus CNRZ10940 i CNRZ1102, opisane jako autolizyny dodatnie, nie były w stanie zakłócić łańcuchów MG1363acmAΔ1 lub CNRZ7 w warunkach opisanych powyżej. Można to wyjaśnić różnicami w składzie peptydoglikanów i swoistością hydrolaz peptydoglikanowych różnych filogenetycznie bakterii .

rola opisywanych tu muramidaz może odgrywać ważną rolę w mieszanych populacjach bakterii w warunkach naturalnych. Wykazaliśmy, że istnienie bakterii w stanie pojedynczej komórki w porównaniu z łańcuchami może w niektórych przypadkach mieć konsekwencje dla wzrostu. Zniszczenie łańcuchów i zmiany prędkości sedymentacji to tylko jeden z przykładów możliwych efektów międzykomórkowego działania hydrolaz peptydoglikanowych. Częściowa hydroliza ściany komórkowej bakterii może mieć również inne skutki. Na przykład niedawno wykazano, że autolizyny wpływają na pierwotne przywiązanie Staphylococcus epidermidis do powierzchni stałych . W świetle naszych wyników możliwe jest, że muramidazy jednego gatunku mogą wpływać na powstawanie biofilmów innego gatunku w obrębie mieszanej społeczności.

podziękowania

Dziękujemy A. Gruss za krytyczną lekturę rękopisu, G. Buist za dar szczepu MG1363acmAΔ1, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik za stymulowanie dyskusji, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber za pomoc w pracach fotograficznych i M. Cavaroc za pomoc techniczną. Dziękujemy P. Tailliezowi za podarunek konkretnych sond fluorescencyjnych.