efectele unei muramidaze asupra unei comunități bacteriene mixte

rezumat

în comunitățile bacteriene o bacterie poate influența creșterea altor membri ai populației. Aceste interacțiuni se pot baza pe factori nutriționali sau pot apărea prin intermediul moleculelor de semnalizare bacteriene care sunt eliberate în mediu. Prezentăm un exemplu, arătând că, pe lângă mijloacele de interacțiune de mai sus, muramidazele, enzimele care scindează în mod specific lanțurile peptidoglican, pot media și interacțiunile dintre bacterii. Folosind hibridizarea fluorescentă in situ demonstrăm că Lactococcus lactis muramidase AcmA poate hidroliza peretele celular al Streptococcus thermophilus, fără a afecta viabilitatea. Această activitate intercelulară a muramidazei lactococice are ca rezultat întreruperea lanțului streptococilor in vivo. Datele noastre ne determină să propunem că lanțurile pot oferi avantaje de creștere streptococilor în condiții aerobe.

1 Introducere

este general acceptat faptul că o bacterie care trăiește în comunități bacteriene complexe poate afecta creșterea vecinilor săi. Interacțiunile dintre bacterii pot fi realizate pe bază nutritivă . Comunicarea intercelulară are loc și prin eliberarea în mediu a diferitelor clase de molecule de semnalizare, permițând astfel bacteriilor să regleze o mare varietate de funcții, cum ar fi autoagregarea, detectarea cvorumului, diferențierea bacteriană și transferul plasmidelor conjugative. Moleculele de semnalizare au fost identificate atât în bacteriile Gram-pozitive, cât și în cele Gram-negative (pentru revizuire, vezi ).

aici prezentăm rezultate care arată că muramidaza, enzima bacteriană care scindează în mod specific peptidoglicanul, poate, de asemenea, să medieze interacțiunile dintre bacterii.

bacteriile pot produce următoarele patru tipuri de enzime care hidrolizează peptidoglicanul peretelui celular: muramidaze, care sunt exemplificate de enzime asemănătoare lizozimelor, glucozaminidaze, amidaze și anumite peptidaze. Activitatea hidrolazei peptidoglican a oricăruia dintre aceste patru tipuri de enzime poate provoca autoliză. Hidrolazele peptidoglican sunt, de asemenea, implicate în procese precum îngroșarea și turnover-ul peptidoglican, diviziunea celulară, competența celulară pentru transformarea ADN-ului, sporularea și motilitatea bacteriană .

Lactococcus lactis ssp. tulpina model cremoris MG1363, vindecată de plasmide și fagi, a fost raportată că conține doar activitatea muramidazei codificată de gena acmA. Această muramidază este responsabilă pentru autoliza lactococilor . Proteina ACMA matură este prezentă atât în mediu, cât și atașată la suprafața celulei prin repetările sale C-terminale . Gena acmA a fost clonată și secvențiată și a fost construit un mutant de deleție, Mg1363acma XV1; mutantul formează lanțuri lungi, arătând astfel implicarea muramidazei în separarea celulelor lactococice . Lanțurile de mutant acmA pot fi perturbate prin adăugarea unui mediu de cultură uzat de tip sălbatic MG1363 .

în această lucrare am examinat capacitatea ACMA muramidazei L. lactis de a acționa asupra streptococilor într-o populație bacteriană mixtă.

2 Materiale și metode

2.1 tulpini bacteriene

2.2 condiții de creștere

experimentele au fost efectuate în mediu M17glu (bulion M17, suplimentat cu 0,5% glucoză ). Temperatura de creștere a fost de 30% C pentru lactococi și de 42% C pentru streptococi și lactobacili. Lanțurile bacteriene au fost perturbate prin adăugarea a 0,01 mg ml−1 de lizozim (Boehringer, Heilderberg, Germania) în mediu, cu excepția cazului în care se indică altfel. Condițiile anaerobe au fost create în borcane cu plicuri Genbox Anaer (Biomextrieux sa, Marcy l ‘ Etoile, Franța). Culturile cultivate în mediu lichid în plăci au fost menținute pe un agitator (Apelex, Massy, Franța, 25 leagăne min−1) pentru a asigura aerarea și pentru a preveni sedimentarea bacteriană.

pentru studiile de sedimentare bacteriile au fost cultivate în cuve de spectrofotometru de 1,5 ml din plastic (Brand, Wertheim, Germania). Diluțiile adecvate ale lactococilor au fost inoculate în mediu lichid sau semi-lichid topit (M17glu cu agar 0,0035%, Difco, Detroit, SUA). După creșterea peste noapte, fotografiile cuvetelor au fost făcute folosind filmul Sensia 400 (Fuji, Tokyo, Japonia).

2.3 hibridizare fluorescentă in situ (FISH), microscopie și analiză de imagine

amestecuri celulare special colorate folosind tehnica FISH , cu sonde specifice pentru lactococi (LAC, etichetat cu fluoresceină, verde) și pentru streptococi (STR, etichetat cu rodamină, roșu; P. Tailliez, Nepublicat). După hibridizare, imaginile au fost capturate folosind un microscop epifluorescență (Nikon, Tokyo, Japonia) și Visiolab 1000 image analysis system (Biocom, Les Ulis, Franța) și prelucrate cu programul Adobe Illustrator 7.0 (Edinburgh, Scoția).

pentru a estima lungimea lanțului bacterian, celulele au fost colorate cu 2,5 ml−1 de dapi (4,6-diamino-2-fenilindol, Sigma, St.Louis, SUA), imaginile au fost capturate cu Visiolab 1000 și lungimea lanțului a fost numărată manual.

3 rezultate

3.1 întreruperea lanțurilor streptococice de către lactococic muramidază AcmA

am considerat că, pe lângă afectarea celulelor din aceeași specie, mg1363 muramidaza ar putea influența, de asemenea, formarea lanțurilor altor specii în populația mixtă. Pentru a testa acest lucru, am folosit tulpini lactococice MG1363 și derivatul său acmA, precum și o tulpină de formare a lanțului S. thermophilus CNRZ7. Am amestecat o cultură peste noapte a streptococilor cu o cultură lactococică în fază exponențială. După o incubare de 3 ore la 30 de centi c, amestecurile celulare au fost fixate și colorate în mod specific folosind tehnica FISH.

în amestecul de streptococi cu MG1363, nu există lanțuri streptococice rămase după 3 ore de incubație. În schimb, în amestecul de CNRZ7 și Mg1363acma XV1, lanțurile ambelor tulpini sunt vizibile (Fig. 1). Deoarece Mg1363acma, Mg11 și Mg1363 sunt izogene și diferă numai în prezența AcmA, concluzionăm că ACMA muramidaza este responsabilă pentru întreruperea lanțurilor streptococice. Tulpina dintr-o altă subspecie lactococică, L. lactis ssp. lactis IL1403, a fost, de asemenea, capabil să perturbe lanțurile streptococice în experimente similare. În aceste culturi mixte, muramidaza lactococică acționează ca un mediator al interacțiunilor dintre două specii, fiecare dintr-un gen diferit, astfel încât muramidaza unei specii poate afecta capacitatea de formare a lanțului unei alte specii.

am întrebat dacă muramidaza lactococică afectează viabilitatea streptococilor în aceste condiții. Celulele CNRZ7 în faze de creștere exponențială sau staționară au fost suspendate în supernatanții de cultură ai Mg1363 și Mg1363acma Inkts1. Nu s-au observat diferențe de viabilitate după incubarea 4 h, după cum s-a evaluat prin placare sau măsurare OD.

3.2 influența lanțurilor bacteriene asupra sedimentării

bacteriile prezente ca lanțuri sedimentează mai rapid decât celulele libere. Când streptococi care formează lanțuri (Fig. 2a), sau L. lactis Mg1363acma XV1 (Fig. 2c) sunt cultivate peste noapte în mediu lichid, formează un sediment în recipient. Tulpina care nu formează lanțuri MG1363 nu sedimentează în aceleași condiții (Fig. 2e). Folosind concentrații scăzute non-bactericide de lizozimă, am putut converti lanțurile de CNRZ7 și ale mutantului Mg1363acma XV1 în starea monocelulară; în aceste condiții, sedimentarea lor este redusă (Fig. 2b și, respectiv, d). În medii semi-lichide se pot distinge coloniile de tulpini Mg1363 și Mg1363acma XV1. Tulpina de tip sălbatic formează colonii cu dungi (Fig. 2h), la fel ca și tulpina Mg1363acma XV1 cultivată cu lizozimă (Fig. 2g). Aceste modele de creștere indică faptul că celulele separate au capacitatea, deși limitată, de a sedimenta în mediu semi-lichid. În schimb, Mg1363acma XV1 formează colonii rotunde (Fig. 2f), ceea ce poate indica faptul că lanțurile lungi împiedică sedimentarea în acest mediu.

aceste exemple arată că distribuția bacteriilor în mediu lichid și semi-lichid este influențată de capacitatea celulelor de a forma lanțuri.

3.3 avantajele de creștere ale S. thermophilus CNRZ7 datorită capacității de formare a lanțului

am folosit tulpina S. thermophilus CNRZ7 pentru a testa modul în care capacitatea de a forma lanțuri influențează creșterea bacteriilor. Streptococii sunt considerați anaerobi facultativi . Culturile peste noapte ale acestor tulpini au fost diluate de 1000 de ori în mediu lichid proaspăt, iar culturile au fost împărțite în două. Lizozima (0,01 mg ml−1) a fost adăugată la unul dintre alicote și fiecare cultură a fost apoi distribuită în continuare în șase tuburi și șase plăci Petri (25 ml pe recipient). Probele au fost incubate fără agitare peste noapte la 42 C. Un alt set de probe a fost incubat în condiții anaerobe. OD600 al tuturor probelor a fost măsurat după diluarea de 10 ori în același mediu la care s-a adăugat lizozima (0,01 mg ml−1) pentru a perturba lanțurile. Rezultatele indică (Tabelul 1) că creșterea celulelor în lanțuri conferă un avantaj streptococilor în mediul aerat. În toate cazurile, cu excepția unuia, randamentul bacterian este mai mare atunci când celulele sunt cultivate pe plăci în comparație cu tuburile. O creștere mai bună a plăcilor care conțin mediu lichid poate fi explicată printr-o distribuție mai uniformă a celulelor pe plăci în comparație cu tuburile, ceea ce ar putea permite astfel un acces mai mare la nutrienți. Excepția se referă la streptococi crescuți în plăci în condiții aerobe cu lizozim. În acest caz s-a observat inhibarea creșterii comparativ cu condițiile anaerobe, cu un raport anaerob:aerob OD600 de 1,4. Când celulele au fost cultivate în tuburi, efectele aerării au fost reduse, iar raportul de creștere a fost de 1,1. Un raport similar a fost obținut atunci când celulele au fost cultivate în mediu fără lizozimă (Tabelul 1).

inhibarea creșterii streptococice în condiții aerobe cu lizozimă poate fi explicată prin întreruperea lanțurilor în celule unice și, prin urmare, sedimentarea mai lentă. Sa raportat că creșterea anaerobilor în mediu lichid fără agitare este inhibată la aproximativ 0,5 cm de la suprafață, din cauza penetrării oxigenului în mediu . În absența lizozimului, CNRZ7 formează lanțuri și sedimente la fundul recipientului, sub zona bogată în oxigen; în acest caz, OD600 pe plăci este puțin mai mare decât cel din tuburi. În schimb, atunci când bacteriile sunt cultivate în mediu cu lizozimă, ele nu formează lanțuri lungi, verificate prin microscopie și sedimente mai lent; în acest caz, mai multe celule rămân în partea superioară a vasului, adică. în zona inhibitoare. Deoarece suprafața zonei de inhibare este mai mare pe plăci decât în tuburi, rezultă că creșterea pe plăci este mai inhibată decât creșterea în tuburi. Valorile densității optice în plăci și tuburi au confirmat acest raționament (Tabelul 1).

o explicație alternativă pentru creșterea aerobă slabă a streptococilor în prezența lizozimului ar putea fi faptul că celulele sunt mai sensibile la lizozim în condiții aerobe sau mai sensibile la oxigen în prezența lizozimului. Pentru a aborda această întrebare, CNRZ7 a fost cultivat peste noapte în plăci ca în experimentul anterior, dar cu concentrații diferite de lizozim. În paralel, un set de plăci au fost menținute în condiții de agitare pentru a preveni sedimentarea și pentru a crește aerarea. Așa cum este prezentat în Fig. 3, randamentul bacteriilor cultivate cu agitare nu a scăzut în funcție de concentrația lizozimului. Acest lucru înseamnă că streptococii nu devin mai sensibili la oxigen atunci când se adaugă lizozima. Atribuim randamentul mai mic al culturilor CNRZ7 cultivate în condiții aerobe inhibării mai mari a oxigenului.

în condiții aerobe fără agitare, observăm o scădere treptată a randamentului în intervalul concentrației de lizozimă de la 2 la 10 hectog ml−1. Ca mai sus, explicăm acest lucru prin sedimentarea lanțurilor bacteriene în zona mai puțin oxigenată din partea inferioară a plăcilor. În agitator nu observăm această scădere a OD, deoarece sedimentarea este împiedicată. În condiții anaerobe, creșterea OD în același interval de concentrații de lizozimă poate fi explicată prin sedimentare redusă și ulterior o distribuție mai uniformă a bacteriilor în mediu. Observațiile microscopice sunt în conformitate cu acest raționament, deoarece lungimea lanțurilor CNRZ7 este mai mare de 100 de celule în mediu fără lizozim și scade treptat la o valoare medie de 2 atunci când concentrația de lizozim a fost crescută la 10 hectog ml−1. Lungimile lanțului au fost aproximativ aceleași în condiții aerobe și anaerobe.

rezultatele de mai sus ne determină să propunem că bacteriile anaerobe pot avea avantaje de creștere care depind de capacitatea lor de a forma lanțuri.

4 discuție

am arătat că muramidaza mediază interacțiunile dintre L. lactis MG1363 și S. thermophilus CNRZ7 și poate determina lungimea lanțului ‘în trans’. Cât de general poate fi acest tip de comportament? Celulele Micrococcus lysodeikticus liofilizate sunt utilizate în mod obișnuit ca indicator al activității autolitice. Rezultatele diferitelor laboratoare arată că autolizinele diferitelor specii bacteriene, de ex. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus sau Staphylococcus aureus, pot distruge peptidoglican de micrococci. De asemenea, alte hidrolaze peptidoglican bacteriene, cum ar fi amidaza sau glucozaminidaza, care sunt autolizine majore ale Bacillus subtilis, pot distruge peptidoglican . Aceste date sugerează că pot exista interacțiuni prin autolizine, care duc la întreruperea lanțului între numeroase specii bacteriene.

o explicație simplă pentru întreruperea observată a lanțurilor streptococice este că peptidoglican este hidrolizat direct de L. lactis muramidaza care este eliberată de MG1363 în mediu. S-au efectuat zymograme pentru a estima cantitatea de activitate hidrolitică prezentă în supernatanții MG1363. Folosind celule micrococale ca substrat, am estimat cantitatea de activitate AcmA să corespundă aproximativ cu cea observată pentru 0,1 hectogg de lizozimă (rezultatele nu au fost prezentate). Alți factori, cum ar fi proteinazele, pot juca, de asemenea, un rol în aceste interacțiuni: s-a demonstrat că introducerea genei proteinazei ancorate în peretele celular clonat în mutantul Mg1363acma Inkts1 are ca rezultat reducerea dimensiunii lanțului . S-a raportat că proteaza lactococică htra este implicată în degradarea ACMA muramidazei , care poate influența, de asemenea, lungimea lanțului.

am demonstrat o activitate eficientă de perturbare a lanțului streptococic prin bacterii filogenetice diferite, dar totuși strâns legate L. lactis ssp. cremoris MG1363 și L. lactis ssp. lactis IL1403 . Interesant, filogenetic mai îndepărtat L. tulpinile helveticus CNRZ10940 și CNRZ1102, descrise ca autolizină pozitivă, nu au putut să perturbe lanțurile de Mg1363acma XV1 sau CNRZ7 în condițiile descrise mai sus. Acest lucru poate fi explicat prin diferențele în compoziția peptidoglican și specificitatea hidrolazelor peptidoglican ale bacteriilor filogenetice diferite .

rolul muramidazelor descrise aici poate juca un rol important în populațiile bacteriene mixte în condiții naturale. Am arătat că existența bacteriilor în starea cu o singură celulă față de lanțuri poate avea, în unele cazuri, consecințe asupra creșterii. Distrugerea lanțurilor și modificările vitezei de sedimentare este doar un exemplu de posibile efecte ale acțiunii intercelulare a hidrolazelor peptidoglican. Hidroliza parțială a peretelui celular bacterian poate avea și alte efecte. De exemplu, sa demonstrat recent că autolizinele afectează atașarea primară a Staphylococcus epidermidis la suprafețele solide . Având în vedere rezultatele noastre, este posibil ca muramidazele unei specii să influențeze formarea biofilmelor unei alte specii într-o comunitate mixtă.

mulțumiri

îi mulțumim lui A. Gruss pentru citirea critică a manuscrisului, G. Buist pentru darul tulpinii Mg1363acma XV1, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik pentru stimularea discuțiilor, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber pentru ajutorul în fotografie și M. Cavaroc pentru ajutor tehnic. Mulțumim P. Tailliez pentru darul sondelor fluorescente specifice.