am construit anterior o tulpină de E. coli care este capabilă să producă itaconat în condiții aerobe prin supraexprimarea CIS-aconitat decarboxilază (cadA) de la A. terreus. Fluxul către itaconat a fost îmbunătățit prin supraexprimarea genelor care codifică citrat sintază (gltA) și aconitază (acnA) din C. glutamicum și eliminarea genelor care codifică fosfotransacetilaza (pta) și lactat dehidrogenaza (ldhA) (Vuoristo și colab. 2015). În condiții anaerobe, E. coli folosește o fermentație acidă mixtă în care sunt sintetizate diverse produse precum acetat, succinat, etanol, formiat, lactat, hidrogen și dioxid de carbon (Clark 1989). Fluxurile la aceste produse și la biomasa din E. coli sunt combinate astfel încât să se mențină un echilibru redox. Producția de itaconat, precum și producția de acetat și piruvat—are ca rezultat reducerea cofactorului, care poate fi echilibrată prin coproducția de succinat și/sau etanol. În acest studiu am investigat dacă este posibilă realizarea producției anaerobe de itaconat în E. coli.
tulpinile de E. coli care au fost dezvoltate anterior pentru producția aerobă de itaconat au fost cultivate în condiții anaerobe. Expresia cadA în E. coli BW25113 (de3) nu a fost suficientă pentru inițierea producției de itaconați. Citrat sintaza din E. coli controlează fluxul prin ciclul acidului citric, deoarece este inhibat alosteric de concentrațiile ridicate de NADH care apar în condiții anaerobe și acest lucru ar fi putut împiedica producerea de itaconat. Citratul sintază din C. glutamicum (GltA) nu este afectat de un astfel de feedback negativ (Eikmanns și colab. 1994). Într-adevăr, coexprimarea acnA și gltA de la C. glutamicum în E. coli BW25113 (de3) a avut un efect pozitiv asupra producției de itaconați, deoarece a dus la producerea de itaconați, dar titrurile au fost scăzute.
deoarece titrul și randamentul itaconatului au fost scăzute, este important să se prevină formarea inutilă a subproduselor. Eliminarea ldhA a suprimat complet producția de lactat, dar eliminarea pta nu a dus la o reducere semnificativă a producției de acetat. O observație similară a fost făcută în condiții aerobe (Vuoristo și colab. 2015) și confirmă existența unor căi alternative pentru producția de acetat.
expresia cadA în E. coli Bw25113 (de3), a fost deja suficientă pentru a evoca producția de itaconat, dar tulpina a acumulat și piruvat și citrat, indicând faptul că calea către itaconat a fost restrânsă. Acumularea de piruvat este probabil cauzată de un dezechilibru redox. Pentru a menține echilibrul redox, E. coli bw25113 (de3) Xiclpta Xicldha trebuie să producă itaconat împreună cu etanol și/sau succinat. Când fluxul către itaconat este prea mic în comparație cu fluxurile către etanol și succinat, tulpinile vor deveni limitate la NADH, ceea ce a dus la acumularea de piruvat. Expresia suplimentară a gltA și acnA din C. glutamicum a stimulat puternic producția de itaconați și a redus cantitatea de piruvat care s-a format, rezultând un titru crescut de itaconat de 8 ori.
am arătat mai devreme că expresia heterologă a cadA duce la formarea corpului de incluziune (Vuoristo și colab. 2015). Strategii pentru creșterea solubilității CadA în E. coli, cum ar fi evoluția proteinelor direcționate în laborator (Yuan și colab. 2005) sau armonizarea codonilor (Angov și colab. 2008) sunt susceptibile de a crește fluxul de aconitat. O altă opțiune este că concentrația intracelulară a itaconatului și lipsa capacității de transport ar putea deveni limitarea ratei, ceea ce a fost propus și de Okamoto și colab. (2014). DauA a fost caracterizat ca principalul transportor de succinat în E. coli, dar s-a demonstrat că transportă și alți acizi dicarboxilici la pH 7 (Karinou și colab. 2013), sugerând că supraexprimarea dauA poate stimula exportul itaconate. Mai mulți transportori de itaconați presupuși au fost caracterizați recent la speciile Aspergillus (Li și colab. 2011; van der Straat și colab. 2014), dar funcționalitatea lor în E. coli nu a fost testată.
în mod neașteptat, glutamatul a fost produs în culturi de E. coli BW25113 (de3), în care s-au exprimat gltA și acnA de C. glutamicum. Metoda UPLC utilizată pentru determinarea glutamatului a arătat, de asemenea, că s–au produs cantități semnificative de alanină (1,5-3% C-mol) în toate tulpinile de E. coli. Aparent, alanina este un produs de fermentație standard al acestei tulpini de E. coli. Căutarea literaturii nu a evidențiat alte studii în care alanina a fost găsită ca produs standard de fermentare a E. coli.
atât sinteza itaconatului, cât și cea a glutamatului concurează pentru aceiași intermediari. Prin urmare, pentru a crește fluxul către itaconat, este necesară reprimarea producției de glutamat. Auxotrofele de glutamat ale E. coli au fost realizate prin eliminarea genelor care codifică fie citrat sintază (gltA) (Mainguet și colab. 2013), aconitază (acnA) (Gruer și colab. 1997) sau izocitrat dehidrogenază (icd) (Lakshmi și Helling 1976). GltA și acnA sunt implicate în producția de itaconate și, prin urmare, sunt candidați nepotriviți. Atât ICD, cât și acna knockouts sunt cunoscute a fi instabile în condiții aerobe, deoarece duc la inactivarea gltA, posibil din cauza unui efect toxic al citratului acumulat intracelular (Gruer și colab. 1997). Totuși, Gruer și colab. (1997) a arătat că knockouts acnA au fost stabile în condiții anaerobe, ceea ce sugerează că mai puțin citrat se acumulează în condiții anaerobe, posibil din cauza reglementării activității GltA de către NADH. Introducerea sintazei citrat insensibile NADH A C. prin urmare, glutamicum în E. coli bw25113 (de3), este posibil să nu fie fezabil. Într-adevăr, încercările de a exprima genele pKV-CGA în tulpină nu au reușit. Chiar și expresia pKV-C, care conține doar cadA, a dus la pierderea unei părți din cadA în timpul creșterii, ceea ce sugerează că instabilitatea knockouts icd poate fi cauzată și de acumularea de concentrații mari de itaconat intracelular.
într-un studiu recent (Okamoto și colab. 2014), CadA a fost exprimată cu succes în tulpina ICD de la sută la sută atunci când a fost cultivată pe mediu LB în condiții aerobe. Supraexprimarea aconitazei (acnB) împreună cu cadA în tulpina ICD de la sută a condus la creșterea producției de itaconați (4,34 g/L). Cu toate acestea, un mediu de creștere complex, cum ar fi LB, care părea să stabilizeze expresia cadA în fundal ICD de la XV, nu este preferat pentru producția chimică în vrac datorită prețului său ridicat. În plus, tulpina ICD de la centimetrul a acumulat o cantitate substanțială de acetat fără o deleție în căile metabolice implicate în metabolismul acetatului, cum ar fi pta, iar autorii au recomandat inactivarea căilor de formare a acetatului. Într-un alt studiu, activitatea Icd A C. glutamicum a fost redus prin schimbul codonului de pornire ATG în GTG sau TTG, care împreună cu o expresie CadA heterologă au dus la 60 mM de itaconat (Otten și colab. 2015).
deoarece producția de glutamat depinde de disponibilitatea azotului în mediu, o strategie alternativă de diminuare a producției de glutamat a fost testată prin cultivarea celulelor în mediu limitat de azot. Acest lucru a sporit producția de itaconate până la 5,4% Cmol cu E. coli BW25113 (de3) Unktipta Untldha pKV-CGA. Îmbunătățirea fluxului de la aconitat la itaconat ar reduce probabil și mai mult cantitatea de producție de glutamat.
Escherichia coli are câteva caracteristici interesante pentru producția anaerobă de itaconat: este unul dintre puținele microorganisme industriale care este capabil să crească în condiții anaerobe. Acetil-CoA-un precursor al itaconatului—este un metabolit central în procesele de disimilare în E. coli, ceea ce nu este cazul eucariotelor precum Saccharomyces cerevisiae-deși mai multe grupuri încearcă să schimbe acest lucru (Kozak și colab. 2014; Lian și colab. 2014). E. coli transformă piruvatul în acetil-CoA și formiat prin piruvat-formiat liază în condiții anaerobe. Formiatul poate fi ulterior împărțit în H2 și CO2 valoroase. Alte tulpini industriale care sunt capabile să crească în condiții anaerobe, cum ar fi S. cerevisiae și bacteriile cu acid lactic, utilizează piruvat dehidrogenază dependentă de NAD pentru a sintetiza acetil-CoA, care generează NADH suplimentar și, prin urmare, necesită o regenerare suplimentară a cofactorului cu prețul substratului.
producția microbiană de acizi organici este studiată de mai multe grupuri . Adăugarea de bază (var) este necesară atunci când acizii organici sunt produși la pH neutru. în timpul procesării în aval, sarea acidului organic trebuie transformată în acid organic, care se face de obicei prin adăugarea de acid sulfuric. Acest lucru duce la producerea de cantități mari de săruri (gips). O abordare alternativă este producerea acidului organic la pH scăzut. E. coli nu poate crește la valori scăzute ale pH-ului, iar producția de acid organic cu E. coli se poate face, prin urmare, numai la valori neutre ale pH-ului.
acest studiu arată că este posibil să se sintetizeze itaconat anaerob prin utilizarea căii acide mixte A E. coli, în care sinteza etanolului/H2 și succinatului regenerează NAD. Etanolul / H2 pare a fi cel mai bun set de coproduse pentru aplicații industriale, deoarece aceste produse pot fi pur și simplu separate pe baza temperaturilor lor de fierbere și ușor comercializate ca substanțe chimice în vrac. Itaconatul și succinatul sunt mai greu de separat, deoarece sunt ambii acizi dicarboxilici cu coloana vertebrală C4. Mai mult, ele pot copolimeriza, ceea ce va avea un impact asupra proprietăților polimerului. Ștergerea fumarat reductazei (frd) este una dintre soluțiile evidente pentru a preveni formarea succinatului (Zhou și colab. 2006).
aceasta este prima dată când a fost raportată producția anaerobă de itaconat din glucoză pentru E. coli. Randamentele și productivitățile observate sunt încă modeste. Eliminarea căilor către subproduse majore precum glutamat, succinat și acetat și îmbunătățirea căii dintre piruvat și itaconat este, prin urmare, crucială pentru obținerea unui proces de producție anaerobă competitiv din punct de vedere al costurilor pentru acidul itaconic.