effekter av ett muramidas på en blandad bakteriegemenskap

Abstrakt

i bakteriesamhällen kan en bakterie påverka tillväxten hos andra medlemmar av befolkningen. Dessa interaktioner kan baseras på näringsfaktorer eller kan uppstå via bakteriella signalmolekyler som frigörs i mediet. Vi presenterar ett exempel som visar att förutom ovanstående interaktionsmedel kan muramidaser, enzymer som specifikt klyver peptidoglykankedjor, också förmedla interaktioner mellan bakterier. Med hjälp av fluorescerande in situ hybridisering visar vi att Lactococcus lactis muramidas AcmA kan hydrolysera cellväggen hos Streptococcus thermophilus, utan att påverka livskraften. Denna intercellulära aktivitet hos laktokockmuramidas resulterar i kedjestörning av streptokocker in vivo. Våra data leder oss att föreslå att kedjor kan ge tillväxtfördelar till streptokocker under aeroba förhållanden.

1 Inledning

det är allmänt accepterat att en bakterie som lever i komplexa bakteriesamhällen kan påverka tillväxten hos sina grannar. Interaktioner mellan bakterier kan realiseras på näringsbasis . Intercellulär kommunikation sker också genom frisättning i mediet av olika klasser av signalmolekyler, vilket gör det möjligt för bakterier att reglera en mängd olika funktioner, såsom autoaggregation, kvorumavkänning, bakteriell differentiering och överföring av konjugativa plasmider. Signalmolekyler har identifierats i både Gram-positiva och gramnegativa bakterier (för granskning, se ).

här presenterar vi resultat som visar att muramidas, det bakteriella enzymet som specifikt klyver peptidoglykan, också kan förmedla interaktioner mellan bakterier.

bakterier kan producera följande fyra typer av enzymer som hydrolyserar cellväggpeptidoglykan: muramidaser, som exemplifieras av lysozymliknande enzymer, glukosaminidaser, amidaser och vissa peptidaser. Peptidoglykanhydrolasaktiviteten hos någon av dessa fyra typer av enzymer kan orsaka autolys. Peptidoglykanhydrolaser är också involverade i processer som peptidoglykanförtjockning och omsättning, celldelning, cellkompetens för DNA-transformation, sporulation och bakteriell motilitet .

Lactococcus lactis ssp. cremoris modellstam MG1363, härdad av plasmider och fager, rapporterades endast innehålla muramid aktivitet kodad av genen acmA. Detta muramidas är ansvarigt för autolys av laktokocker . Moget AcmA-protein är närvarande både i mediet och fäst vid cellytan via dess C-terminala upprepningar . AcmA-genen klonades och sekvenserades, och en deletionsmutant, Mg1363acma Bisexuell 1, konstruerades; mutanten bildar långa kedjor, vilket visar involvering av muramidas i laktokockcellseparation . Kedjor av acmA-mutant kan störas genom tillsats av använt odlingsmedium av vildtyp MG1363 .

i detta arbete undersökte vi förmågan hos AcmA muramidas av L. lactis att verka på streptokocker i en blandad bakteriepopulation.

2 Material och metoder

2.1 bakteriestammar

2.2 tillväxtbetingelser

experiment utfördes i m17glu medium (M17 buljong, kompletterad med 0,5% glukos ). Tillväxttemperaturen var 30 CCG för laktokocker och 42 CCG för streptokocker och laktobaciller. Bakteriekedjor stördes genom tillsats av 0, 01 mg ml−1 lysozym (Boehringer, Heilderberg, Tyskland) till mediet, om inte annat anges. Anaeroba förhållanden skapades i burkar med Genbox Anaer-påsar (biom Oxirieux SA, Marcy l ’ Etoile, Frankrike). Kulturer odlade i flytande medium i plattor bibehölls på en shaker (Apelex, Massy, Frankrike, 25 svänger min−1) för att ge luftning och för att förhindra bakteriell sedimentering.

för sedimenteringsstudier odlades bakterier i plast 1,5 ml spektrofotometerkuvetter (Brand, Wertheim, Tyskland). Lämpliga utspädningar av laktokocker inokulerades i flytande eller smält halvvätskemedium (M17glu med 0,0035% agar, Difco, Detroit, USA). Efter tillväxt över natten togs fotografier av kyvetter med Sensia 400-film (Fuji, Tokyo, Japan).

2.3 fluorescerande in situ hybridisering (fisk), mikroskopi och bildanalys

Cellblandningar specifikt färgade med FISH-tekniken , med sonder specifika för laktokocker (LAC, märkt med fluorescein, grön) och för streptokocker (STR, märkt med rhodamin, röd; P. Tailliez, opublicerad). Efter hybridisering fångades bilder med hjälp av ett epifluorescensmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) och Visiolab 1000 bildanalyssystem (Biocom, Les Ulis, Frankrike) och bearbetades med Adobe Illustrator 7.0-programmet (Edinburgh, Skottland).

för att uppskatta bakteriell kedjelängd färgades celler med 2,5 occurg ml−1 av DAPI (4,6-diamino-2-fenylindol, Sigma, St.Louis, USA), bilder fångades med Visiolab 1000 och kedjelängd räknades manuellt.

3 resultat

3.1 störning av streptokockkedjor med laktokockmuramidas AcmA

vi ansåg att förutom att påverka celler av samma art kan mg1363 muramidas också påverka kedjebildning av andra arter i blandad population. För att testa detta använde vi laktokockstammar MG1363 och dess acmA-derivat, liksom en kedjebildande S. thermophilus-stam CNRZ7. Vi blandade en nattkultur av streptokockerna med en laktokockkultur i exponentiell fas. Efter en 3-h inkubation vid 30 c c fixerades cellblandningar och färgades specifikt med användning av FISKTEKNIKEN.

i blandningen av streptokocker med MG1363 finns inga streptokockkedjor kvar efter 3 h inkubation. I motsats till detta är kedjor av båda stammarna synliga i blandningen av CNRZ7 och Mg1363acma 21 (Fig. 1). Eftersom Mg1363acma 21 och Mg1363 är isogena och skiljer sig endast i närvaro av AcmA, drar vi slutsatsen att AcmA muramidas är ansvarig för störning av streptokockkedjor. Stammen från en annan laktokock underart, L. lactis ssp. lactis IL1403, kunde också störa streptokockkedjor i liknande experiment. I dessa blandade kulturer fungerar laktokockmuramidas som en förmedlare av interaktioner mellan två arter, var och en av ett annat släkt, så att muramidas av en art kan påverka den kedjebildande förmågan hos en annan art.

vi frågade om laktokockmuramidas påverkar livskraften hos streptokocker under dessa förhållanden. CNRZ7-celler i exponentiella eller i stationära tillväxtfaser suspenderades i odlings supernatanter av MG1363 och Mg1363acma 21. Inga skillnader i livskraft observerades efter 4 h inkubation, som bedöms genom plätering eller OD-mätning.

3.2 påverkan av bakteriekedjor på sedimentering

bakterier närvarande som kedjor sediment snabbare än fria celler. När kedjebildande streptokocker (Fig. 2a), eller L. lactis Mg1363acma 2C1 (Fig. 2C) odlas över natten i flytande medium, de bildar ett sediment i behållaren. Den icke-kedjebildande stammen MG1363 sedimentera inte under samma förhållanden (Fig. 2e). Med hjälp av låga icke-baktericidala koncentrationer av lysozym kunde vi konvertera kedjor av CNRZ7 och av mg1363acma Bisexuell 1 mutant till singelcellstillståndet; under dessa förhållanden reduceras deras sedimentering (Fig. 2b respektive D). I halvflytande mediumkolonier av stammar MG1363 och Mg1363acma kan man skilja Mellan1. Vildtypsstammen bildar strimmiga kolonier (Fig. 2h), liksom mg1363acma Asic1-stammen odlad med lysozym (Fig. 2g). Dessa tillväxtmönster indikerar att separerade celler har kapacitet, även om de är begränsade, till sediment i halvvätska medium. I kontrast bildar Mg1363acma Excepili1 runda kolonier (Fig. 2f), vilket kan indikera att de långa kedjorna förhindrar sedimentering i detta medium.

dessa exempel visar att fördelningen av bakterier i flytande och halvflytande medium påverkas av cellernas förmåga att bilda kedjor.

3.3 tillväxt fördelar med S. thermophilus CNRZ7 på grund av kedjebildande förmåga

vi använde S. thermophilus stam CNRZ7 för att testa hur förmågan att bilda kedjor påverkar tillväxten av bakterier. Streptokocker anses vara fakultativa anaerober . Nattkulturer av dessa stammar späddes 1000 gånger i färskt flytande medium och kulturerna delades i två. Lysozym (0,01 mg ml−1) tillsattes till en av alikvoterna, och varje kultur fördelades sedan vidare i sex rör och sex Petri-plattor (25 ml per behållare). Proverna inkuberades utan att skaka över natten vid 42 kcal C. En annan uppsättning prover inkuberades under anaeroba förhållanden. OD600 av alla prover mättes efter 10-faldig utspädning i samma medium till vilket lysozym (0,01 mg ml−1) tillsattes för att störa kedjor. Resultaten indikerar (Tabell 1) Att tillväxt av celler i kedjor ger en fördel för streptokocker i luftad miljö. I alla fall utom en är bakterieutbytet högre när celler odlas på plattor jämfört med rör. Bättre tillväxt i plattor som innehåller flytande medium kan förklaras av en jämnare fördelning av celler på plattor jämfört med rör, vilket därmed kan ge större tillgång till näringsämnen. Undantaget gäller streptokocker odlade i plattor under aeroba förhållanden med lysozym. I detta fall observerade vi tillväxthämning jämfört med anaeroba förhållanden, med ett anaerobt:aerobt OD600-förhållande på 1,4. När celler odlades i rör reducerades effekterna av luftning och tillväxtförhållandet var 1,1. Ett liknande förhållande erhölls när celler odlades i medium utan lysozym (Tabell 1).

inhiberingen av streptokocktillväxt under aeroba förhållanden med lysozym kan förklaras av störning av kedjor i enstaka celler och följaktligen långsammare sedimentering. Det rapporterades att tillväxten av anaerober i flytande medium utan skakning hämmas till ca 0,5 cm från ytan på grund av penetration av syre i mediet . I frånvaro av lysozym bildar CNRZ7 kedjor och sediment till botten av behållaren, under den syrerika zonen; i detta fall är OD600 på plattor något högre än i rör. Däremot, när bakterier odlas i medium med lysozym, bildar de inte långa kedjor, vilket verifieras genom mikroskopi och sediment långsammare; i detta fall förblir fler celler i den övre delen av kärlet, d. v. s. i den hämmande zonen. Eftersom inhiberingszonens yta är större på plattor än i rör följer det att tillväxt på plattor hämmas mer än tillväxt i rör. Värdena för optisk densitet i plattor och rör bekräftade detta resonemang (Tabell 1).

en alternativ förklaring till dålig aerob tillväxt av streptokocker i närvaro av lysozym kan vara att celler är mer känsliga för lysozym vid aeroba förhållanden eller mer känsliga för syre i närvaro av lysozym. För att ta itu med denna fråga odlades CNRZ7 över natten i plattor som i föregående experiment, men med olika koncentrationer av lysozym. Parallellt upprätthölls en uppsättning plattor under skakningsförhållanden för att förhindra sedimentering och för att öka luftningen. Som presenteras i Fig. 3 minskade inte utbytet av bakterier som odlades med skakning som en funktion av lysozymkoncentrationen. Detta betyder att streptokocker inte blir känsligare för syre när lysozym tillsätts. Vi tillskriver lägre utbyte av CNRZ7-kulturer odlade under aeroba förhållanden till högre syrehämning.

vid aeroba förhållanden utan skakning observerar vi en gradvis minskning av utbytet i intervallet lysozymkoncentration från 2 till 10 occygg ml−1. Som ovan förklarar vi detta genom sedimentering av bakteriekedjor till den mindre syresatta zonen längst ner på plattorna. I skakan observerar vi inte denna minskning av OD eftersom sedimentering förhindras. Under anaeroba förhållanden kan ökningen av OD i samma intervall av lysozymkoncentrationer förklaras av minskad sedimentering och efterföljande jämnare fördelning av bakterier i mediet. Mikroskopiska observationer är i enlighet med detta resonemang, eftersom längden av CNRZ7−kedjor är mer än 100 celler i medium utan lysozym och gradvis sjunker till ett medelvärde av 2 när lysozymkoncentrationen ökades till 10 occygg ml-1. Kedjelängderna var ungefär desamma vid aeroba och anaeroba förhållanden.

ovanstående resultat leder oss att föreslå att anaeroba bakterier kan ha tillväxtfördelar som beror på deras förmåga att bilda kedjor.

4 diskussion

vi har visat att muramidas förmedlar interaktioner mellan L. lactis MG1363 och S. thermophilus CNRZ7 och kan bestämma kedjelängden ’i trans’. Hur allmänt kan denna typ av beteende vara? Lyofiliserade Micrococcus lysodeikticus-celler används rutinmässigt som en indikator på autolytisk aktivitet. Resultat från olika laboratorier visar att autolysiner av olika bakteriearter, t. ex. Enterococcus hirae, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, L. helveticus eller Staphylococcus aureus, kan förstöra peptidoglykan av mikrokocker. Även andra bakteriella peptidoglykanhydrolaser, som amidas eller glukosaminidas, som är Huvud autolysiner av Bacillus subtilis, kan förstöra peptidoglykan . Dessa data tyder på att interaktioner via autolysiner, vilket resulterar i kedjeavbrott kan existera mellan många bakteriearter.

en enkel förklaring till den observerade störningen av streptokockkedjor är att peptidoglykan hydrolyseras direkt av L. lactis muramidas som frigörs av MG1363 i mediet. Zymogram utfördes för att uppskatta mängden hydrolytisk aktivitet närvarande i mg1363 supernatanter. Med hjälp av mikrokokala celler som substrat uppskattade vi mängden AcmA-aktivitet för att motsvara ungefär den som observerades för 0,1 occygg lysozym (resultat visas inte). Andra faktorer, såsom proteinaser, kan också spela en roll i dessa interaktioner: det visade sig att införandet av klonad cellväggsförankrad proteinasgen i mg1363acma Macau1 mutant resulterar i minskning av kedjans storlek . Laktokock-htra-proteaset rapporterades vara involverat i nedbrytning av AcmA-muramidas , vilket också kan påverka kedjelängden.

vi visade effektiv streptokockkedjeförstörande aktivitet genom fylogenetiskt olika men ändå nära besläktade bakterier L. lactis ssp. cremoris MG1363 och L. lactis ssp. lactis IL1403 . Intressant, fylogenetiskt mer avlägsen L. helveticus-stammarna CNRZ10940 och CNRZ1102, beskrivna som autolysinpositiva, kunde inte störa kedjor av Mg1363acma eller Cnrz7 under betingelser som beskrivits ovan. Detta kan förklaras av skillnader i peptidoglykankomposition och specificitet av peptidoglykanhydrolaser av fylogenetiskt olika bakterier .

muramidas roll som beskrivs här kan spela en viktig roll i blandade bakteriepopulationer under naturliga förhållanden. Vi har visat att förekomsten av bakterier i singelcellstillståndet kontra kedjor i vissa fall kan få konsekvenser för tillväxten. Förstöring av kedjor och förändringar av sedimenteringshastighet är bara ett exempel på möjliga effekter av den intercellulära verkan av peptidoglykanhydrolaser. Delvis hydrolys av bakteriell cellvägg kan också ha andra effekter. Till exempel visades det nyligen att autolysiner påverkar primär bindning av Staphylococcus epidermidis till fasta ytor . Med tanke på våra resultat är det möjligt att muramidaser av en art kan påverka bildandet av biofilmer av en annan art inom ett blandat samhälle.

bekräftelser

vi tackar A. Gruss för kritisk läsning av manuskriptet, G. Buist för gåvan av mg1363acma Bisexuell 1 stam, P. Duwat, I. Poquet, J. Richard, R. Cibik för att stimulera diskussioner, P. Regent, B. Nicolas, M. Weber för hjälp i foto-Arbete och M. Cavaroc för teknisk hjälp. Vi tackar P. Tailliez för gåvan av specifika fluorescerande sonder.